Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Resumo

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Resumo

As células podem detectar e migram para as concentrações mais elevadas de pistas adesivas, tais como as glicoproteínas da matriz extracelular e as pistas solúveis, tais como factores de crescimento. Aqui, descrevem um método para criar gradientes opostos de pistas adesivas e solúvel em uma câmara de microfluidos, que é compatível com imagens de células vivas. Um copolímero de ácido poli-L-lisina e o polietileno glicol (PEG-PLL) é empregada para passivar lamelas de vidro e prevenir a adsorção não especifica de biomoléculas e células. Microcontact impressão seguinte, ou litografia dip caneta são usados ​​para criar as faixas de estreptavidina nas superfícies passivadas para servir como pontos de fixação para o péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como a pista adesiva. Um dispositivo de microfluidos é colocada sobre a superfície modificada e usados ​​para criar o gradiente de pistas adesivas (100% RGD a RGD 0%) nas faixas de estreptavidina. Finalmente, o mesmo dispositivo de microfluidos é usado para criar um gradiente de uma suc chemoattractanth como soro fetal bovino (FBS), como o cue solúvel na direcção oposta do gradiente de pistas adesivas.

Introdução

Migração dirigida de células é uma propriedade fundamental de muitas células e é um aspecto-chave de muitos processos fisiológicos normais, incluindo o desenvolvimento embrionário, a defesa contra a infecção e cicatrização de feridas. Além disso, a migração de células também desempenha um papel importante em várias doenças tais como a doença vascular, metástase de células tumorais e de ^1,2 a inflamação crónica. Embora os estados clássicos da migração das células - polarização, extensão saliência, a formação de aderência, a geração de forças de retracção e de trás - são geralmente aceites ^3,4, a elucidação dos mecanismos de espaço-temporais, que ....

Protocolo

1. Passivação de lamínulas com PLL-PEG-biotina

Este passo é projetado para passivar a superfície para que as células aderem e migram para regiões específicas na lamela de vidro que são criados com a impressão microcontract (Passo 2-3a) ou mergulho litografia caneta (Passo 3b). Para a passivação, um co-polímero de poli-L-lisina (PLL) e polietileno glicol (PEG) é usado em que 20% das moléculas de PEG são enxertados com biotina (PLL-PEG-biotina).

1. Para limpar lamelas de vidro (18 mm x 18 mm), submergindo-os em uma cremalheira em etanol a 100% e colocar o suporte de um banho de sonicação durante 30 min. Secam-se as lamelas de vidro ....

Resultados

Para compreender como a célula de integrar os sinais migratórios ^25, foi desenvolvido um método para células de imagem com a microscopia de fluorescência, que migram em um ambiente com concorrentes gradientes adesivas e solúvel (Figura 1). Faixas adesivas que continham estreptavidina fluorescente e RGD biotinilado foram criados com faixas microcontact impressos e mergulho litografia caneta (Figura 2). Impressão microcontact sucesso é indicado pela linha de perfil de intensida.......

Discussão

Neste protocolo, foi utilizado um dispositivo disponível comercialmente microfluídicos (sticky Slide-Quimiotaxia ^{3D a} partir de Ibidi) para estudar os efeitos de superfícies quimicamente modificados e gradientes quimioatratantes sobre a migração celular. Esta instalação não requer microfluídico porque o gradiente de fluxo é estabelecido por difusão ao longo do comprimento do canal. Isto é importante porque o fluxo poderia afectar diferencialmente células migram lentamente, tais como fibroblastos, que formam e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coverglass manchando roupas Thomas	Scientific	8542 E40	Coverslip rack
Forno	Binder		ED 53 série
Wafer de silício	Silicon Quest	708-007	Boro dopado < 100> wafer, 4" de diâmetro, 500 μ m, polido de lado único
GM1070 SU-8 fotorresistente	Gersteltec Sarl
SU-8 revelador	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 agente de cura	Dow Corning
Sylgard 184 pré-polímero de elastômero	Dow Corning
PLL-PEG-biotina (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)	1 mg/ ml em PBS
Fluoresceína	Sigma	46955	1 mM em PBS
Estreptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml em PBS
Biotina-4-fluoresceína	Invitrogen	B-1370	0,03 μ g/μ l em
PBS Biotina-RGD	GenScript	SC1208	0,03 mg/ml em PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μ M em PBS
Quimiotaxia de corrediça pegajosa 3D	Ibidi	80328
200 μ l Greiner ponta chanfrada amarela	Greiner Bio-One	739261
Vaselina	Sigma	16415
Cera de parafina, mp 55-57 ° C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μ m cantilever	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Plugin de rastreamento manual	Fabrice Cordeliè res		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Ferramenta de quimiotaxia e migração	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html