Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica
Summary
Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.
Abstract
Estudos anteriores mostraram que o knockdown de ITSN-1s (KD ITSN), uma proteína envolvida na regulação de endocitose permeabilidade vascular pulmonar e células endoteliais (ECs) a sobrevivência, a morte celular induzida por apoptose, um obstáculo importante no desenvolvimento de um sistema de cultura celular, com períodos prolongados ITSN-1s inibição 1. Usando lipossomas catiônicos como carreadores, exploramos o silenciamento do gene ITSN-1s nos pulmões do rato pela administração sistêmica de siRNA visando ITSN-1 gene (ITSN siRNA). Lipossomas catiônicos oferecem várias vantagens para entrega siRNA: cofre com doses repetidas, não imunogénico, não tóxico, e fácil de produzir 2. Lipossomas desempenho e actividade biológica depende do seu tamanho, carga, a composição lipídica, a estabilidade, a dose e via de administração de 3 Aqui, eficiente e ITSN KD específica em pulmões do rato foi obtida utilizando uma combinação de colesterol dioctadecil brometo de amónio e dimetil. Entrega intravenosade ITSN siRNA / complexos de lipossomas catiônicos transitoriamente derrubado proteína ITSN-1s e mRNA em pulmões de ratos no dia 3, que se recuperou depois de mais 3 dias. Aproveitando os lipossomas catiónicos como um transportador segura repetível, o estudo alargado para 24 dias. Assim, o tratamento retro-orbital com complexos recém-gerados foi administrado a cada 3 dias, induzindo ITSN KD sustentado ao longo do estudo 4. Tecidos de camundongos coletadas em vários pontos tempo ITSN pós-siRNA foram submetidos a análises de microscopia eletrônica (ME) para avaliar os efeitos da crônica KD ITSN, no endotélio pulmonar. High-resolution EM imagens nos permitiu avaliar as alterações morfológicas causadas por KDITSN no leito vascular pulmonar (ou seja, o rompimento da barreira endotelial, diminuição do número de caveolae e regulação positiva de vias de transporte alternativos), características não-detectável por microscopia de luz. Em geral estes resultados estabeleceu um importantetante papel de ITSN-1s na função de ECs e homeostase do pulmão, enquanto que ilustra a eficácia da prestação de siRNA lipossomas in vivo.
Introduction
SiRNA Nu não pode penetrar na membrana da célula, a ser carregada negativamente, e que é facilmente degradado por enzimas no sangue, tecidos e células. Até recentemente, com modificações estruturais para melhorar a estabilidade, a acumulação de siRNA no local alvo depois da administração é extremamente baixo e requer um veículo intracelular eficiente 5. Lipossomas catiónicos emergiu como seguros transportadoras ácidos nucleicos com o potencial de transferência de grandes pedaços de DNA / RNA em células, encapsulando e protegendo os ácidos nucleicos a partir da degradação enzimática 6. Além disso, lipossomas catiónicos interagem espontaneamente com o ADN / ARN, promovendo assim a transferência de genes para as células 2. Mais recentemente, os lipossomas têm sido aplicadas para proporcionar vacinas e os medicamentos de baixo peso molecular 7. Entrega lipossomal de microRNA-7-expressando plasmídeo supera receptor do factor de crescimento epidérmico tirosina-quinase inibidor de resistência em células de cancro do pulmão 8. Quando visando oendotélio vascular, a administração intravenosa é essencial porque os complexos que não são susceptíveis de atravessar a barreira endotelial e extravasamento para o interstício 9. Em comparação com outros órgãos, ECs da microvasculatura do pulmão têm a maior absorção e avidamente internalizar lipossoma catiónico e complexos de ADN / ARN, seguido dos gânglios linfáticos e placas de Peyer 9. Entrega intravenosa em modelos de roedores de siRNA através de injecções veia retro-orbital ou cauda foi provado inofensivos mesmo em concentrações elevadas, tais como 50 mg / kg 10. Na literatura publicada a composição de lipossomas catiónicos é diferente, com base na formulação de lípidos e a sua razão molar 11, 12. Existe uma grande variedade de aplicações potenciais utilizando lipossomas catiónicos para a distribuição de genes in vivo, quer visando down-regulation/over-expression das proteínas, a entrega de vacinas ou de terapias anti-tumorais 13-15. Importante lembraré que a eficiência da interacção de membrana de DNA / RNA celular é regulada pela forma de acoplamento entre os complexos gerados e lípidos de membrana. Isto sugere que a adaptação da composição para os perfis de lípidos da membrana celular alvo pode ser benéfico e resultam em elevadas taxas de transfecção num determinado tipo de célula 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com base em estudos anteriores publicadas por outros 9 e nos 1, 18 que desenvolvemos esta metodologia para o longo prazo derrubar de ITSN-1s in vivo pela administração intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 dias consecutivos) de siRNA específico / complexos de lipossomas. Esta abordagem experimental é eficiente, pode ser utilizado de forma segura e repetida e pode ser facilmente estendido para estudar o envolvimento de um gene que codifica toda a proteína de interesse no endo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde R01HL089462 para SP.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
Referências
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