استهدفت-استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED) يدعم تحليل الديناميات داخل الخلايا مخزن الكالسيوم عن طريق التصوير مضان. تستند هذه الطريقة على استهداف من إستيراز الكربوكسيل المؤتلف إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER)، حيث أنه يحسن إماطة اللثام المحلية الاصطناعية منخفضة تقارب كا<sup> 2 +</sup> الأصباغ مؤشر في التجويف ER.
تصور ديناميات الكالسيوم المهم أن نفهم دور الكالسيوم في علم وظائف الأعضاء الخلية. لدراسة ديناميات الكالسيوم، أصبحت الاصطناعية الفلورسنت كا 2 + المؤشرات شعبية. هنا علينا أن نظهر TED (= يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل)، وهي طريقة لتحسين الإفراج عن كا 2 + الأصباغ مؤشر في التجويف ER من أنواع مختلفة من الخلايا. حتى الآن، تم استخدام TED في خطوط الخلايا، والخلايا الدبقية، والخلايا العصبية في المختبر. قواعد TED على كفاءة، المؤتلف استهداف نشاط إستيراز الكربوكسيل عالية لمعة ER باستخدام ناقلات التركيبات التي Carboxylesterases صريح (CES). أحدث ناقلات TED تحتوي على عنصر أساسي من CES2 تنصهر لبروتين أحمر فلوري، وبالتالي تمكين المتزامن التصوير اللونين. يتم تصوير ديناميات الكالسيوم الحرة في ER في لون واحد، في حين يظهر هيكل ER المقابلة باللون الأحمر. في بداية الإجراء، والخلايا transduced مع الفيروسة البطيئة. وفي وقت لاحق، والخلايا المصابة لإعادة المصنف coverslips على لتمكين أخيرا التصوير الخلية الحية. ثم، يتم تحضين الخلايا الحية مع استر acetoxymethyl (AM-استر) شكل من الاسعار المنخفضة للتقارب كا 2 + المؤشرات، على سبيل المثال Fluo5N-AM، MAG-Fluo4-AM، أو ماج-Fura2-AM. يتم تشكيل النشاط استريز في ER يشق قبالة سلاسل الجانب مسعور من النموذج AM من كا 2 + المؤشر وماء صبغة الفلورسنت / كا 2 + معقدة والمحاصرين في التجويف ER. بعد صبغ التحميل، ويتم تحليل الخلايا في مقلوب ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي. و perfused الخلايا باستمرار مع حلول قارع الأجراس تشبه وديناميات الكالسيوم ER هي تصور مباشرة بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. يتم التعرف الافراج الكالسيوم من ER من انخفاض في كثافة مضان في المناطق ذات الاهتمام، في حين أن إعادة تعبئتها من مخزن الكالسيوم ER تنتج زيادة في كثافة مضان. وأخيرا، يتم تحديد التغير في كثافة الفلورسنت بمرور الوقت من خلال حساب ΔF / F 0.
من أجل حل الاستجابات الفسيولوجية الكالسيوم من ER، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة لتحسين محاصرة من الكالسيوم الاصطناعية الأصباغ الحساسة في ER. تمكن الطريقة المباشرة وغير مدمرة في الوقت الحقيقي رصد الحر ER الكالسيوم في وجود الكالسيوم خارج الخلية.
وظيفة وإشارات من الكالسيوم ER
تم العثور على إشارات الكالسيوم في الخلية أنواع مختلفة، مثل خلايا العضلات، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وتتراوح الوظائف من التوسط تقلص العضلات لتورطه في انتقال متشابك في التعلم والذاكرة 1،2. التغييرات في تركيز الكالسيوم الحرة هي ذات أهمية علمية عالية لأن الكالسيوم ويشارك في تنظيم النسخ الجيني، تكاثر الخلايا، استثارة الخلايا العصبية، موت الخلايا والخلايا الأخرى مما يشير الأحداث 1-7. وترتبط وظيفيا كل هذه الإشارات الخلوية الكالسيوم داخل الخلايا وتساهم في الكالسيوممخزن 8-10 ديناميكية.
ثمة سمة مشتركة بين جميع إشارات الكالسيوم هو تدفق الكالسيوم بين الفضاء خارج الخلية، العصارة الخلوية والعضيات، وعلى رأسها ER والميتوكوندريا. هذا يسبب تغيرات ديناميكية في تركيز الكالسيوم داخل هذه العضيات، والتي لمست من قبل مكونات إشارات مختلفة. في العام، وتركيز الكالسيوم في نطاقات ER بين 100-800 ميكرون، في العصارة الخلوية تركيز الكالسيوم على مقربة من 100 نانومتر، وفي الفضاء خارج الخلية تركيز حوالي 1-2 ملم. وفقا لذلك، هناك قوة دافعة عالية الكيميائية لتدفق الكالسيوم نحو العصارة الخلوية 2،9،10.
تعتمد إشارات الكالسيوم ER-استمدت معظم التحقيق عادة على تحفيز مستقبلات البروتين G-يقترن (GPCR)، التي تنشط ثم فسفوليباز C (PLC). PLC بدورها تنتج اينوزيتول 1،4،5-trisphosphate (IP 3) 1. عند ربط الملكية الفكرية 3 إلى تفصيل لهاeptor (IP-3 التوصية، الشكل 1) في ER-الغشاء، يتم الافراج أيونات الكالسيوم من لمعة ER. تاريخيا، كان IP إطلاق الكالسيوم 3 بوساطة من لائحة الأول – حتى ولو بشكل غير مباشر – في قياس خلايا البنكرياس عنيبية بواسطة Streb وآخرون في عام 1983 11. واقترح هذا المنشور لأول مرة شلال إشارات تنطوي على أستيل، فسفوليباز C، وIP 3. هذه الطريقة في إطلاق الكالسيوم ويطلق عموما IP إطلاق الكالسيوم 3 التي يسببها (IiCR) (الشكل 1). التنشيط التي تعتمد على كيناز من فسفوليباز Cγ بواسطة مستقبلات tyrosin تحركات روابط العمل من عوامل النمو وعوامل عصبية إلى ER الكالسيوم مما يشير IP بعد 3 الارتفاع 12. بالإضافة إلى IiCR، قد يتم بوساطة ارتفاع الكالسيوم عن طريق دخول الكالسيوم ionotropic، على سبيل المثال عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات (كا V)، وإطلاق الكالسيوم الكالسيوم التي يسببها اللاحقة (CICR) من خلال إعادة ryanodineمستقبلات (RYR). وترتبط IiCR وCICR الناحية الفسيولوجية لدخول الكالسيوم المخزن التي تديرها (SOCE). يتضمن SOCE عمل STIM (ستروما جزيء التفاعل)، وهو جهاز استشعار لإطلاق الكالسيوم ER. وقد تبين STIM لتحفيز دخول الكالسيوم خارج الخلية من خلال قنوات عابر مستقبلات المحتملة (التربتوفان) 13، وقنوات الكالسيوم Orai 14 وحتى قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 15 (الشكل 1). فقدان ER الكالسيوم هو انقاذ حيوي بواسطة العمل من الكالسيوم شبكية هيولي باطني أتباز-ساركو (SERCA)، الذي بنشاط مضخات الكالسيوم مرة أخرى في ER. منع SERCA مع عقاقير مثل thapsigargin، يكشف عن استمرار فقدان الكالسيوم ER إلى المقصورة عصاري خلوي. ويتسبب هذا ER الكالسيوم "تسرب" بواسطة ER intramembrane المجمعات المسام مثل بروتين معقد Sec61 16،17 (الشكل 1).
في عام 1998، نشرت Berridge نموذجا، و "الخلايا العصبية ضمن نموذج الخلايا العصبية"، حركتيح يشير إلى وجود دور الفسيولوجية مبدأ ER في دمج الخلايا العصبية الكالسيوم 5. ويرى هذا النموذج وجود نظام مستمر غشاء ER تشكيل الخلايا "صورة" من غشاء البلازما الخلايا العصبية 5. وقد ادعى هذا النظام غشاء حقيقية النواة الثنائية لتكون شرط أساسي لتحقيق التكامل الزمانية والمكانية للإشارات الكالسيوم السريعة والبطيئة في الخلايا العصبية. وتمنح إشارات الكالسيوم التي تحدث إما بالتزامن أو في وقت لاحق في العمود الفقري التشعبات المختلفة أو من نفس العصبون إلى سوما الخلية أو النواة عبر ER، حيث تتلخص أنها تصل 5،18. ثم، قد يكون لها آثار مجموعهما على استثارة الخلايا العصبية، وتنظيم النسخ الجيني أو التكامل من أجهزة الطرد المركزي الإشارة. وهكذا، فإن ER يدعم دمج إشارات الكالسيوم. واحد شرط مسبق لهذا المفهوم هو استمرارية ER في خلية واحدة، والتي تم الادعاء من قبل العديد من الدراسات والتي ثبت على الأقل لsomato-Dالمناطق endritic ومسافة قصيرة التوقعات محور عصبي 19-21. ما إذا كان هناك استمرارية ER ضمن التوقعات محور عصبي طويل هو موضوع نقاش.
استراتيجيات لقياس تدفق الكالسيوم مجانا عبر غشاء ER
في معظم الأحيان يتم رصد إشارات الكالسيوم في العصارة الخلوية 22،23. وبالتالي، فإنه لا يمكن بسهولة أن تميز سواء كا 2 + والتي تصب في العصارة الخلوية من خارج الخلية أو من مخازن داخل الخلايا 6،24. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعت استراتيجيات منهجية لمباشرة التصوير الكالسيوم ER. في ملخص، يتم استخدام الاستراتيجيات التالية: (1) ER-استهدفت المهندسة وراثيا، مؤشرات بروتين 25-27 كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب البروتين على أساس استخدام البروتين GFP إضاءة الحيوية aequorin أو في توليفة مع البروتين الاستشعار الكالسيوم. هذا كا 2 + المؤشرات المعدلة وراثيا (GECIs) ويمكنأن تستهدف لائحة مع مساعدة من الببتيد إشارة ويتم الاحتفاظ بنشاط في ER باستخدام الاستبقاء وعزر استرجاعها. مشترك ER كا 2 + مؤشرات على قاعدة مبدأ كمليون وهي كمليون YC4.3 26،28؛ كمليون الانقسام YC7.3ER 29، وD1 كمليون 30. (2) تحميل مباشر صبغ المستندة إلى استريز من AM-استر منخفضة تقارب كا 2 + المؤشرات 31،32. AM-مشتقات الأصباغ مؤشر (ماج-Fura2-AM، MAG-Fluo4-AM أو Fluo5N-AM) تمرير الأغشية البيولوجية في محبة للدهون، دولة الكالسيوم الأحرف. ثم، في العصارة الخلوية وكذلك في لائحة، الاسترات الذاتية يلتصق الفريق AM-استر والإفراج عن كا 2 + المؤشر، مخلفين وراءهم كمية معينة من صبغة نشطة في العصارة الخلوية وفي ER. ولذلك، فإن هذا النهج هو مفيد في ظل ظروف من تركيز عالية من الكالسيوم في ER طالما يبقى تركيز الكالسيوم عصاري خلوي أقل بكثير من ديالحد بحماية المناخ من المؤشرات المنخفضة تقارب، ولا سيما خلال إشارات الكالسيوم مميزة (مثل نانومتر إلى ميكرومتر منخفض). (3) تحميل AM-استر في تركيبة مع غشاء البلازما permeabilization 32. تتم إزالة أي المتبقية عصاري خلوي كا 2 + المؤشر بواسطة غشاء البلازما permeabilization مع كميات صغيرة من المنظفات "خفيفة" (على سبيل المثال سابونين) في وجود مخزن مؤقت داخل الخلايا الاصطناعية. وبالتالي، قد يكون حافزا للأغشية الخلايا، على سبيل المثال مع IP 3 في المخزن المؤقت داخل الخلايا، مباشرة من خلال "مسام" في غشاء البلازما. (4) غسيل الكلى من العصارة الخلوية ضمن تكوين خلية كاملة والقياسات في وقت واحد من كا 2 + في التجويف ER والعصارة الخلوية 32،33. يتم تحميل الخلية الأولى مع انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال ماج-Fura2- AM، ratiometric، ضوء الأشعة فوق البنفسجية). بعد ذلك، مع مساعدة من ماصة التصحيح، أي CYT المتبقيةوdialysed osolic منخفضة تقارب كا 2 + مؤشر للخروج من العصارة الخلوية مع العازلة التي تحتوي على نسبة عالية تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال فلوو-3، الضوء المرئي). تمكن هذه الاستراتيجية في وقت واحد تسجيل الاشارات عصاري خلوي وER مشتقة. (5) التي تستهدف استريز التي يسببها صبغ التحميل 8،34. A إستيراز الكربوكسيل (CES) والتي تستهدف تجويف ER ويوفر النشاط استريز السامية لمحاصرة كفاءة من النموذج AM-استر من كا 2 + مؤشرات الاسعار المنخفضة للتقارب.
التي يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل (TED)
لتحسين استهداف كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب إلى ER التجويف، وقد وضعت TED. يتطلب TED على overexpression من وER إستيراز الكربوكسيل الماوس المستهدفة (CES2) (الشكل 2)، والذي يتحقق من خلال بنيات التعبير. يتم تحضين الخلايا معربا عن المؤتلف CES-بناء مع شكل AM-استر من الكالسيوم فيdicator صبغ (Fluo5N-AM، الشكل 2). ثم، في لائحة، يتم تحويل الصبغة إلى كا 2 + حساسة، غشاء كتيمة كا 2 + مجمع مؤشر (Fluo5N/Ca 2 +) من قبل النشاط استريز عالية، وبالتالي محاصرة الصبغة في تركيز عال في التجويف ER 8 ، 34. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للتحقيق ER الكالسيوم الإفراج عبر مسارات-IiCR على سبيل المثال عن طريق metabotropic purinergic أو الغلوتامات المستقبلات، 8،34 وتصور استنزاف الكالسيوم ER عبر "قنوات تسرب" مباشرة، على سبيل المثال بعد الحصار المفروض على SERCA 17 ، 34. لتجربتنا انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر Fluo5N-AM حاليا أفضل مؤشر متاحة للاستخدام مع استراتيجية جار صبغ TED. Fluo5N-AM يحتوي على نسبة منخفضة تقارب لكا 2 + (التفكك المستمر K D ~ 90 ميكرون، الشكل 2)، هي تقريبا غير الفلورسنت في تقريرها AM-شكل، ولكنها توفر الانبعاثات مضان عالية على calciuم ملزمة 8،34. يمكن متحمس Fluo5N/Ca 2 + معقدة مع مصدر ضوء معيار من ~ 490 نانومتر، والتي تتطابق مع الأصباغ القياسية مثل FITC، اليكسا 488، أو EGFP. إشارات الكالسيوم عصاري خلوي نكاد نبلغ تركيز في نطاق ميكرومتر منخفضة، وبالتالي يتم الكشف عنها من قبل بالكاد Fluo5N في العصارة الخلوية 35.
لتحسين أداء TED، وقد وضعت عدة بنيات ناقلات المؤتلف (الشكل 3). في الأصل، وناقلات TED على أساس تسلسل الترميز من CES2 (Refseq انضمام عدد NM_145603، CES2c) وأفضل أداء TED لوحظ مع التعبير المستقرة للبنيات CES. ناقلات TED نيو اكسبريس عنصرا أساسيا من CES2 تنصهر في البروتين مضان أحمر TagRFP-T2 36. هذه النواقل لها ميزة أنها يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا transduced واستخدام مضان أحمر باعتبارها الرقابة الداخلية لتطبيع التغييرات في Fluo5N/Ca 2 + مضان. كما يقدم مضان أحمر إمكانية لتصور توزيع الهيكلي للER والتغيرات في ديناميات ER في ظل ظروف التحفيز.
وقد نوقشت مزايا وعيوب الأسلوب TED على نطاق واسع في المنشورات الحديثة 34،35. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه، TED تلتف مشكلة تعطيل وperfusing الخلايا. وعلاوة على ذلك، لا بد من التأكيد على جانبين. مبدأ TED لER الكالسيوم التصوير يتطلب (1). التعبير المستهدفة من إستيراز …
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) BL567/3-1 وفريدريش باور شتيفتونغ. ونود أن نشكر روجر تسين Y.، معهد هوارد هيوز الطبي المختبرات في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو لتزويدنا تاج RFP-T2. ونحن نعترف لله الحمد ديفيد بالتيمور، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في باسادينا، وديدييه Trono، جامعة جنيف، جنيف، لتقديم لنا lentiviral البلازميدات FUGW، وpsPAX2/pMD2.G.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
Materials | |||
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |