הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Summary

ממוקד ולין מושרה טעינת צבע (טד) תומכת בניתוח של דינמיקת חנות סיד תאיות על ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מתבססת על המיקוד של Carboxylesterase רקומביננטי לreticulum endoplasmic (ER), שבו משפר את הסרת המסכות המקומית של סינטטי נמוכה זיקת Ca^{2 +} צבעי חיווי בלומן ER.

Abstract

ויזואליזציה של דינמיקת סידן חשובה להבין את תפקידו של הסידן בפיזיולוגיה תא. כדי לבחון את דינמיקת סידן, Ca ^{2 +} דדי ניאון סינטטיים הפכו פופולריים. כאן אנו מדגימים TED (= טעינת צבע מושרה ממוקד-esterase), כדי לשפר את שיטת השחרור של Ca ^{2 +} צבעי חיווי בלומן ER של תאים מסוגים שונים. נכון להיום, טד היה בשימוש בשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים במבחנה. בסיסים על TED יעיל, רקומביננטי מיקוד של פעילות carboxylesterase גבוהה ללום ER באמצעות וקטור מבנים שCarboxylesterases Express (CES). וקטורי TED האחרונים מכילים רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי אדום, ובכך מאפשרים הדמיה בשני צבעים בו זמנית. הדינמיקה של סידן חופשי בחדר המיון הם צילמו בצבע אחד, ואילו את מבנה חדר המיון המקביל מופיע באדום. בתחילתו של ההליך, תאי transduced עם lentivirus. בהמשך, התאים הנגועיםזורעים מחדש על coverslips סוף סוף יאפשר הדמיה תא חי. לאחר מכן, תאי חיים מודגרת עם אסתר acetoxymethyl (AM-אסתר) טופס הזיקה נמוכה Ca ^{2 +} מחוונים, למשל Fluo5N-AM, מאג-Fluo4-AM, או מאג-Fura2-AM. פעילות ולין בדבק ER את צד רשתות הידרופובי מהטופס הנני Ca ^{2 +} חיווי ומורכב ⁺ צבע / Ca ² ניאון הידרופילי נוצר ונלכדה בלומן ER. לאחר טעינת צבע, התאים מנותחים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך. תאי perfused ברציפות עם פתרונות כמו צלצול ואת דינמיקת סיד ER הן ישירות דמיינו ידי הדמיה זמן לשגות. שחרור סידן מחדר המיון מזוהה על ידי ירידה בעוצמת הקרינה באזורים של עניין, בעוד שהמילוי של חנות סיד ER מייצר עלייה בעוצמת הקרינה. לבסוף, השינוי בעוצמת ניאון לאורך הזמן נקבע על ידי חישוב ΔF / F _0.

Introduction

על מנת לפתור את התגובות פיסיולוגיות של סידן לחדר המיון, פיתחנו אסטרטגיה חדשה על מנת לשפר את ההשמנה של צבעים רגישים סינטטיים סידן לחדר המיון. השיטה מאפשרת ניטור הישיר, שאינו מפריע בזמן אמת של סידן ER החופשי בנוכחות של סידן תאי.

פונקציה ואיתות של סידן ER

אותות סידן נמצאים בסוגים שונים של תאים, תאי שרירים למשל, נוירונים ותאי גלייה ומגוון הפונקציות שלהם מתיווך התכווצות שרירים למעורבות בהעברה הסינפטית בלמידה ובזיכרון ^1,2. שינויים בריכוז הסידן חופשי הם עניין מדעי גבוה בגלל סידן הוא מעורב בוויסות של שעתוק הגנים, התפשטות תאים, רגישות עצבית, מוות של תאים ותא אחרים מאותת אירועים ^1-7. כל אותות הסיד הסלולריים אלה מחוברים באופן פונקציונלי ולתרום לתאיים סיד^8-10 דינמיקת חנות.

תכונה משותפת בין כל אותות סידן היא הזרימה של סידן בין המרחב תאי, cytosol ואברונים, בעיקר ER ומיטוכונדריה. זה גורם לשינויים דינמיים בריכוז סידן בתוך אברונים אלה, החשים ידי רכיבי איתות שונים. באופן כללי, ריכוז הסידן בטווחי ER בין 100-800 מיקרומטר, בcytosol ריכוז הסידן הוא קרוב ל -100 ננומטר, ובמרחב תאי הוא הריכוז סביב 1-2 מ"מ. בהתאם לכך, יש כוח מניע כימי גבוה לזרימת הסידן לקראת cytosol ^2,9,10.

את אותות סיד ER-derived נחקרו לרוב תלויים בגירוי של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCR), אשר לאחר מכן מפעילים פוספוליפאז C (PLC). המועצה המחוקקת הפלסטינית בתורו מייצרת אינוזיטול 1,4,5-trisphosphate (IP ₃₎ ^1. על הכריכה של _3-IP לreceptor (IP _3-Rec, איור 1) בחדר מיון הקרום, יוני סידן משתחררים מחדר מיון הלום. מבחינה היסטורית, שחרור סידן ₃ בתיווך ה-IP מחדר המיון היה ראשון – גם אם בעקיפין – שנמדד בתאי לבלב acinar ידי Streb et al בשנת 1983 ^11.. פרסום זה הציע בפעם הראשונה מפל איתות מעורב אצטילכולין, פוספוליפאז C, ו-IP _3. בדרך זו של שחרור סידן שמכונה בדרך כלל שחרור סידן-Induced _3-IP (IiCR) (איור 1). הפעלת קינאז תלויה של Cγ פוספוליפאז ידי קישורי tyrosin קינאזות קולט הפעולה של גורמי גדילה וגורמי neurotrophic לחדר מיון לאחר שסידן איתות IP ₃ גובה ^12. בנוסף לIiCR, גובה סידן עשויה להיות מתווך על ידי כניסת סיד ionotropic, למשל דרך ערוצי מתח מגודרת סידן (Ca _V), ושחרור סידן-Induced סיד הבא (CiCR) על ידי ryanodine מחדשceptors (RyR). IiCR וCiCR קשורים מבחינה פיזיולוגית לכניסת סידן מופעל חנות (SOCE). SOCE כולל פעולה של STIM (מולקולת האינטראקציה סטרומה), שהוא חיישן לשחרור סידן ER. STIM הוכח לעורר כניסת הסידן תאית באמצעות ערוצים חולפים קולט פוטנציאלי (TRP) ^{13, 14} Orai ערוצי סידן ואפילו מתח מגודרת ערוצי סידן ¹⁵ (איור 1). אובדן של סידן ER הוא חולץ על ידי הפעולה דינמי של reticulum סיד ATPase sarco-endoplasmic (SERCA), אשר באופן פעיל משאבות סידן בחזרה לחדר המיון. חסימת SERCA עם תרופות כגון thapsigargin חושפת אובדן מתמשך של סידן לתא ER cytosolic. סיד "דליפה" ER זו נגרמת על ידי נקבוביות מתחמי intramembrane ER כגון חלבון המורכב Sec61 ^16,17 (איור 1).

בשנת 1998, שפורסם Berridge מודל, "נוירון במסגרת מודל נוירון", אשרשעות מצביעות על תפקיד פיסיולוגי עיקרון של חדר המיון בשילוב סידן עצבי ^5. מודל זה לוקח בחשבון את קיומה של מערכת קרום ER רציפה יוצרת "תמונה" תאית של קרום הפלזמה העצבי ^5. מערכת קרום אוקריוטים ינארי זו טענה שהוא תנאי בסיסי לשילוב של זמן ומרחב של אותות סידן מהירים ואיטיים בתאי עצב. אותות סידן המתרחשים גם במקביל או לאחריו בקוצים או דנדריטים שונים של אותו תא העצב הם העניקו לסומה של התא או גרעין באמצעות חדר המיון, שם הם סיכם ^5,18. לאחר מכן, הסכום שלהם עשוי להיות השפעה על הרגישות של הנוירון, הרגולציה של שעתוק הגנים או שילוב של מפלי איתות. לפיכך, לחדר המיון תומך בשילוב של אותות סידן. תנאי אחד למושג הזה הוא ההמשכיות של ER בתא בודד, אשר כבר נטען על ידי מספר מחקרים ואשר הוכח, לפחות לsomato-Dאזורי endritic ומרחקים קצרים תחזיות axonal ^19-21. בין אם יש המשכיות ER בתוך תחזיות axonal ארוכות הוא עניין של ויכוח.

אסטרטגיות כדי למדוד את זרימת הסידן חופשי על פני קרום ER

אותות סידן מנוטרים בתדירות הגבוהה ביותר ^ב22,23 cytosol. לכן, הוא לא יכול בקלות להבחין אם Ca ^{2 +} זורם לתוך cytosol מתאי או מחנויות ^6,24 תאיות. כדי להתגבר על מגבלה זו, אסטרטגיות מתודולוגיות להדמית סיד ER הישירה פותחו. לסיכום, את האסטרטגיות הבאות משמשות: (1) ER-ממוקד מהונדסים גנטי חלבון אינדיקטורים ^25-27 Ca ^{2 +} אינדיקטורים זיקה נמוכה מבוססי חלבון להשתמש בחלבון bioluminescent aequorin או GFP בשילוב עם חלבון חישת סיד.. Ca ^{2 +} אינדיקטורים אלה מהונדסים גנטי (GECIs) יכוליםלהיות ממוקד לחדר המיון עם העזרה של פפטיד אות ונשמרים באופן פעיל בחדר המיון באמצעות שימור ומוטיב אחזור. ^{2 +} בסיס משותף ER Ca אינדיקטורים על עיקרון Cameleon והם Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon פיצול YC7.3ER ^29, וCameleon D1 ^30. (2) טעינת צבע מבוססת ולין ישירה של AM-אסתר נמוכה זיקת Ca ^{2 +} אינדיקטורים ^31,32. AM-נגזרים של צבעי החיווי (מג-Fura2-AM, מאג-Fluo4-AM או Fluo5N-AM) להעביר את ממברנות ביולוגיות במדינה lipophilic, בסידן חסרת רגישות. ואז, בcytosol, כמו גם בחדר המיון, esterases אנדוגניים לדבוק בקבוצת AM-אסתר ולשחרר את מחוון Ca ^{2 +,} והותיר אחריו כמות מסוימת של צבע פעיל בcytosol ובחדר המיון. לכן, גישה זו היא שימושית בתנאים של ריכוז סידן גבוה בחדר המיון, כל עוד ריכוז הסידן cytosolic נשאר הרבה מתחת לדהמגבלת tection של הזיקה נמוכה מחוונים, במיוחד באותות סידן אופייניים (ננומטר למשל למיקרומטר הנמוך). (3) טוען AM-אסתר בשילוב עם קרום הפלזמה permeabilization ^32. כל Ca ^{2 +} מחוון cytosolic הנותרים הוסר על ידי permeabilization קרום הפלזמה עם כמויות קטנות של חומר ניקוי "קל" (למשל saponin) בחיץ מלאכותי תאי. לפיכך, את הקרומים תאיים עשויים להיות מגורה, למשל עם ה-IP ₃ בחיץ תאי, ישירות דרך "נקבוביות" בקרום הפלזמה. (4) דיאליזה של cytosol תחת תצורה כל התא ומדידות בו זמניות של Ca ^{2 +} בלומן ER וcytosol ^32,33. תא טעון ראשון עם זיקה נמוכה Ca ^{2 +} מדד (לדוגמה: מאג-Fura2- בבוקר, ratiometric, UV-אור). לאחר מכן, בעזרת תיקון פיפטה, כל שנותר CYTCa ^{2 +} מדד נמוך הזיקה osolic הוא dialysed מתוך cytosol עם מאגר המכיל Ca ^{2 +} מדד גבוהה זיקה (למשל Fluo-3, אור הנראה). אסטרטגיה זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של אותות שמקורם cytosolic וחדר מיון. (5), הנגרמת ממוקד ולין טעינת צבע ^8,34. Carboxylesterase (CES) הוא ממוקד ללומן של ER ומספק פעילות ולין גבוהה ללכידה יעילה של טופס AM-אסתר זיקה נמוכה Ca ^{2 +} מחוונים.

מושרה ממוקד ולין טעינת צבע (טד)

כדי לשפר את המיקוד של זיקה נמוכה Ca ^{2 +} אינדיקטורים ללום ER, טד היה מפותח. TED דורש ביטוי היתר של carboxylesterase ER ממוקד עכבר (CES2) (איור 2), אשר מושגת באמצעות בונה ביטוי. תאים המבטאים CES-מבנה רקומביננטי מודגרת עם טופס AM-אסתר של סידן בdicator הצבע (Fluo5N-AM, איור 2). לאחר מכן, בחדר המיון, לצבוע מומר לCa ^{2 +} רגיש, הקרום חדיר Ca ^{2 +} מחוון מורכב (Fluo5N/Ca ^{2 +)} על ידי פעילות ולין הגבוהה, ולכן לוכד את הצבע בריכוז גבוה בלומן ER ^{8 , 34.} השיטה שימושית במיוחד כדי לחקור בסידן שחרור ER דרך IiCR-המסלולים למשל באמצעות קולטנים metabotropic, purinergic או גלוטמט ^8,34 ולדמיין דלדול סיד ER באמצעות "ערוצי דליפה" ישירות, למשל, לאחר מצור של ¹⁷ SERCA ^{, 34.} הניסיון שלנו נמוכה זיקה Ca ^{2 +} מחוון Fluo5N-AM הוא כיום האינדיקטור הטוב ביותר שקיים לשימוש עם אסטרטגיית טעינת צבע TED. יש Fluo5N-AM נמוכה זיקה לCa ^{2 +} (דיסוציאציה קבועה K _D ~ 90 מיקרומטר, איור 2), הוא כמעט לא פלורסנט בצורת AM-, אבל מספק פליטת הקרינה גבוהה על Calciuמ 'מחייב ^{8,34. +} המורכב Fluo5N/Ca ² יכול להיות נרגש עם מקור אור סטנדרטי של ~ 490 ננומטר, אשר תואם את צבעים סטנדרטיים כגון FITC, Alexa 488, או eGFP. אותות סידן cytosolic בקושי להגיע לריכוז בטווח מיקרומטר הנמוך ולכן הם בקושי זוהו על ידי Fluo5N ^ב35 cytosol.

כדי לשפר את הביצועים של TED, כמה מבני וקטור רקומביננטי פותחו (איור 3). במקור, וקטורי TED המבוססים על רצף הקידוד של CES2 (Refseq הצטרפות מספר NM_145603, CES2c) והביצועים הטובים ביותר TED הוא ציין עם ביטוי יציב של מבני CES. וקטורים חדשים TED להביע את רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי האדום TagRFP-T2 ^36. יש הווקטורים האלה יש יתרון כי הם יכולים לשמש כדי לזהות transduced תאים ולהשתמש בקרינה האדומה כבקרה פנימית לנורמליזציה של שינויים בFluo5N/Ca ^{2 +} הקרינה. הקרינה האדומה מציעה גם את האפשרות לדמיין את החלוקה המבנית של חדר המיון והשינויים בדינמיקת ER בתנאי גירוי.

Protocol

פרוטוקול זה מציג TED יחול על שורות תאים, נוירונים בהיפוקמפוס ותאי גלייה בקליפת המוח. TED ביצועים הטובים ביותר כאשר וקטורי TED באים לידי ביטוי ביציבות, למשל על ידי וקטורי lentiviral. סקירה סכמטי של שיטת TED מוצגת באיור 4. 1. הכנת פתרונו?…

Representative Results

פרוטוקול זה מספק גישה ללא הפרעה להדמיה ישירה של סידן חדר המיון ללא תשלום. הזיקה נמוכה הסינטטי Ca 2 + האינדיקטורים שפורסמו ונלכדו בלומן ER בעזרת ER ממוקד, פעילות אנזים רקומביננטי ולין. טעינה משופרת של 2 + Ca צבעי החיווי ללום ER מאפשרת הדמיה ישירה ומהירה של דינמ?…

Discussion

את היתרונות והחסרונות של שיטת TED כבר נדונו בהרחבה בפרסומים האחרונים ^34,35. בהשוואה לשיטות אחרות שתוארו לעיל, TED עוקף את הבעיה של שיבוש ומרוסס בתאים. יתר על כן, שני היבטים צריכים להדגיש. העיקרון של TED לחדר מיון סיד דורש הדמיה (1). הביטוי ממוקד של carboxylesterase הפעיל בלומן ER ?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.