Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Samira Samtleben; Juliane Jaepel; Caroline Fecher; Thomas Andreska; Markus Rehberg; Robert Blum

doi:10.3791/50317

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Artigo de método

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

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DOI:

10.3791/50317

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7 de maio de 2013

Samira Samtleben¹ , Juliane Jaepel¹^,² , Caroline Fecher¹ , Thomas Andreska¹ , Markus Rehberg³ , Robert Blum¹

¹Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, ²Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, ³Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Neste artigo

Resumo

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade Ca^{2 +} Corantes indicador no lúmen ER.

Resumo

Visualização da dinâmica do cálcio é importante para entender o papel do cálcio na fisiologia celular. Para examinar a dinâmica de cálcio, Ca ^{2 +} indicadores fluorescentes sintéticos tornaram-se populares. Aqui demonstramos TED (= targeted-esterase induzida corante de carga), um método para melhorar a libertação de ^{Ca2 +} corantes indicadoras no lúmen do ER de diferentes tipos de células. Até à data, o TED foi utilizado em linhas de células, células gliais e neurónios, in vitro. TED sobre bases eficientes, recombinante alvo de uma atividade de alto carboxilesterase para o lúmen ER usando vetores construções que carboxilesterases rápidas (CES). Os últimos vectores TED contendo um elemento de núcleo de CES2 fundida com uma proteína fluorescente vermelha, permitindo assim imagiologia simultânea de duas cores. A dinâmica do cálcio livre na ER são gravadas em uma cor, enquanto a estrutura ER correspondente aparece em vermelho. No início do processo, as células foram transduzidas com um lentivírus. Posteriormente, as células infectadas are semeadas em lamínulas para finalmente permitir imagens de células vivas. Em seguida, as células vivas são incubadas com o éster acetoximetílico (AM-éster) forma de baixa afinidade Ca ^{2 +} indicadores, por exemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou Mag-Fura2-AM. A actividade de esterase nos cliva fora do ER cadeias laterais hidrófobas da forma AM do indicador de Ca ^{2 +} e de um corante fluorescente / Ca ^{2 +} complexo hidrófilo é formado e preso no lúmen do ER. Depois de corante de carga, as células foram analisadas num microscópio confocal laser scanning invertido. As células são continuamente perfundido com soluções de Ringer-like e as dinâmicas ER cálcio são diretamente visualizados por imagem time-lapse. Libertação de cálcio a partir do ER é identificado por uma redução na intensidade de fluorescência em regiões de interesse, enquanto que o reenchimento da loja ER cálcio produz um aumento na intensidade de fluorescência. Finalmente, a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo é determinada pelo cálculo da Af / F _0.

Introdução

A fim de resolver as respostas fisiológicas de cálcio do ER, desenvolvemos uma nova estratégia para melhorar a retenção de corantes sensíveis cálcio sintéticos para o ER. O método permite o monitoramento em tempo real direto, sem interrupções de livre ER cálcio na presença de cálcio extracelular.

Função e sinalização de cálcio ER

Sinais de cálcio são encontradas em diferentes tipos de células, células musculares, por exemplo, neurónios e células gliais e a sua gama de funções de mediar a contração do músculo a um envolvimento na transmissão sináptica na aprendizagem e na memória ^1,2. As altera....