GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas
Summary
No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.
Abstract
Ensaios de chave em enzimologia para a caracterização bioquímica de proteínas in vitro, necessitam de elevadas concentrações de proteína purificada de interesse. Protocolos de purificação de proteína deve combinar eficiência, simplicidade e eficácia de custo 1. Aqui, nós descrevemos a GST-His método como um novo sistema de purificação por afinidade em pequena escala para as proteínas recombinantes, com base em um N-terminal de etiqueta de glutationa-Sepharose (GST) de 2,3 e uma marcação 10xHis C-terminal de 4, que são ambos fundida para a proteína de interesse. A última construção é usado para gerar baculovírus, para a infecção de células Sf9 infectadas para a expressão da proteína 5. GST é uma marca bastante longo (29 kDa), que serve para garantir a eficiência da purificação. No entanto, pode influenciar as propriedades fisiológicas da proteína. Por isso, é subsequentemente clivado da proteína usando a enzima PreScission 6. A fim de assegurar a máxima pureza e para remover a GST clivada, nósadicionou-se uma segunda etapa de purificação por afinidade com base na comparativamente pequena de His. Mais importante, a nossa técnica é baseada em duas etiquetas diferentes flanqueiam as duas extremidades da proteína, que é uma ferramenta eficaz para remover as proteínas degradadas e, portanto, enriquece proteínas de comprimento total. O método aqui apresentado não requer uma configuração instrumental caros, tais como FPLC. Além disso, incorporamos MgCl2 e lavagens de ATP para remover impurezas da proteína de choque térmico e tratamento nuclease abolir contaminando ácidos nucléicos. Em resumo, a combinação de duas marcas diferentes flanqueiam o N-e C-terminal e a capacidade para clivar um dos marcadores, garante a recuperação de uma proteína altamente purificada e de comprimento completo de interesse.
Introduction
A purificação de proteínas recombinantes é crucial para tratar de questões fundamentais em bioquímica. As formas convencionais de purificação de proteínas, como a cromatografia de permuta iónica e cromatografia de exclusão de tamanho dependem de propriedades físicas da proteína-alvo, tais como o seu ponto isoeléctrico e carga ou tamanho, respectivamente. As características da proteína últimos são partilhados por uma variedade de proteínas, o que aumenta consideravelmente a probabilidade de as proteínas contaminantes, em estratégias de purificação de proteínas convencionais. Este problema pode ser contornado com o uso de várias colunas de purificação, o que é demorado. Ao mesmo tempo, os últimos métodos de cromatografia de exigir configuração experimental caro. A purificação por afinidade-tag aumenta fortemente a especificidade do alvo, tal como na maioria dos casos, a marcação será único para a proteína de interesse. Em estudos recentes, com Flag ou HA-purificação de afinidade tem sido amplamente usado.
Em contraste com rec existenteprotocolos de purificação de proteínas ombinant em que tags simples são utilizados, foi estabelecida a combinação única de duas tags. O nosso método envolve a fusão de uma etiqueta de GST na extremidade N-terminal e uma cauda de His no terminal C da proteína de interesse, para uma óptima relação entre a quantidade e pureza da proteína desejada. A GST é uma marca longa (29 kDa), que é altamente eficiente para a purificação sobre Sepharose de glutationa. Além disso, utilizando GST garante boa relação custo-eficácia de nosso método 1. A possibilidade de se clivar a GST com o enzima PreScission (com a sequência de reconhecimento LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, resultando na adição de apenas dois aminoácidos) tem muitas vantagens, por exemplo, esta estratégia evita a alteração das funções fisiológicas de proteínas devido a impedimento alostérico. O pequeno His-tag fundido com o outro extremo da proteína serve num segundo passo de purificação para aumentar a pureza da proteína por lavando a GST clivada, bem como proteínas degradadas e outros contaminantes. Além disso, o protocolo não requer um passo de diálise quando se muda de GST para a coluna passo His-purificação (resina TALON). Contaminantes comuns em tais processos de purificação são proteínas de choque térmico (HSP). A adição de um passo de incubação com MgCl2 e ATP permite a remoção desses contaminantes (Figura 1).
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) são técnicas comuns que dependem instrumentação dispendiosa para gerar um rendimento elevado de proteína purificada de interesse. O protocolo de purificação de lote apresentamos aqui, em contraste, é manual e não necessita de uma instalação instrumental caro. Um rendimento elevado de proteína pode ser alcançado com a expansão do protocolo. Ao mesmo tempo, com o protocolo de purificação do lote, o volume de eluição pode ser ajustada, a fim de aumentar a concentração de proteína, o que não é dada com FPLC ou HPLC.
ntent "> Além disso, com a GST-His protocolo de purificação do lote, proteínas com uma gama de dimensões de ~ 10-300 kDa pode ser purificada. Uma das maiores vantagens é dada pelo facto de que se pode purificar várias proteínas ao mesmo tempo , por exemplo, tanto um de tipo selvagem e a sua proteína mutante. O sucesso do protocolo apresentado apenas depende do nível de expressão e a solubilidade da proteína de interesse.Protocol
Representative Results
Discussion
A GST-His protocolo de purificação aqui apresentada é adequada para a purificação de uma ampla gama de tamanhos de proteínas recombinantes: Foram purificados com sucesso Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e um alto teor de proteína de peso molecular de instável Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Além disso, as proteínas purificadas com este protocolo foram bioquimicamente ativo 6. O sucesso deste método depende unicamente da expressão, solubil…
Acknowledgements
Agradecemos a Anne-Marie Dion-Cote para discussões que levaram ao desenvolvimento do método. JK e RB são FQNRT estudiosos de doutorado, M.-MG é um estudioso Vanier CIHR e J.-YM é pesquisador sênior FRSQ. Este trabalho foi apoiado por fundos de Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia de JY. M.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
Referências
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