माउस पल्मोनरी endothelial सतह परत के vivo मापन में
Summary
endothelial सतह / glycocalyx endothelial परत आदर्श intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अध्ययन किया है. Intravital माइक्रोस्कोपी तकनीकी रूप से फेफड़ों के रूप में एक चलती अंग में चुनौती दे रहा है. हम प्रदर्शन कैसे युगपत brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्वतंत्र रूप से बढ़ने में endothelial सतह परत मोटाई का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है<em> Vivo में</em> माउस फेफड़ों.
Abstract
endothelial glycocalyx proteoglycans और संबद्ध glycosaminoglycans संवहनी लुमेन अस्तर की एक परत है vivo में, glycocalyx अत्यधिक हाइड्रेटेड है, एक पर्याप्त endothelial सतह परत (ईएसएल) कि endothelial समारोह के रखरखाव के लिए योगदान के गठन. के रूप में endothelial glycocalyx अक्सर इन विट्रो में न्यायपालिका और मानक ऊतक निर्धारण तकनीक के दौरान खो दिया है, ESL के अध्ययन intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग की आवश्यकता है. सबसे अच्छा अनुमानित वायुकोशीय microvasculature की जटिल शरीर क्रिया विज्ञान, फेफड़े intravital इमेजिंग आदर्श एक आज़ादी से बढ़ फेफड़ों पर किया जाता है. इन तैयारी, तथापि, आम तौर पर व्यापक गति artifact से पीड़ित हैं. हम प्रदर्शन कैसे बंद छाती एक स्वतंत्र रूप से चलती माउस फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी fluorescently लेबल उच्च आणविक भार dextrans endothelial सतह से ESL अपवर्जन के माध्यम glycocalyx अखंडता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह गैर वसूली सर्जिकल तकनीक है, जो आवश्यकतायुगपत brightfield और माउस फेफड़ों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग, confounding फेफड़ों की चोट उत्प्रेरण के सबूत के बिना subpleural microvasculature के अनुदैर्ध्य अवलोकन के लिए अनुमति देता है.
Introduction
vivo में, glycocalyx अत्यधिक हाइड्रेटेड है, एक पर्याप्त endothelial सतह (ईएसएल) परत है कि endothelial कार्यों का एक तरल पदार्थ पारगम्यता 1, न्युट्रोफिल endothelial सहित विभिन्न प्रकार को नियंत्रित बनाने endothelial glycocalyx proteoglycans और संबद्ध glycosaminoglycans संवहनी intima अस्तर के एक बाह्य परत है. 2 आसंजन, और तरल पदार्थ कतरनी तनाव 3 की mechanotransduction.
ऐतिहासिक, glycocalyx सभ्य सेल 4 तैयारी, 5 मानक ऊतक निर्धारण और 6 प्रसंस्करण के दौरान और उसके पतन में अपनी विषमता के कारण underappreciated किया गया है. बढ़ती उपयोग intravital माइक्रोस्कोपी का (vivo माइक्रोस्कोपी IVM) 7 ESL के स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान नाड़ी समारोह को महत्व में बढ़ वैज्ञानिक ब्याज के साथ आया है. ESL प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए अदृश्य है और आसानी से नहीं कर सकते हैं लेबलvivo फ्लोरोसेंट glycocalyx बाध्यकारी lectins आरबीसी 8 समूहन और घातक फेफड़े emboli (अप्रकाशित टिप्पणियों) के कारण की प्रवृत्ति को देखते हुए,. कई परोक्ष दृष्टिकोण इसलिए गैर चलती ऐसे cremasteric और mesenteric microcirculations के रूप में संवहनी बेड में ESL मोटाई (और विस्तार के द्वारा, glycocalyx अखंडता) परिणाम निकालना विकसित किया गया है. इन तकनीकों endothelial झिल्ली (microparticle छवि velocimetry 9) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भारी, fluorescently लेबल संवहनी मार्कर (जैसे dextrans) के बहिष्कार के माप से endothelial सतह से दूरी के एक समारोह के रूप में microparticle वेग परिसंचारी में मतभेद की माप (dextran अपवर्जन तकनीक 10, 11). इन तकनीकों का, केवल dextran अपवर्जन समय में एक ही बिंदु पर किए गए माप से ESL मोटाई का आकलन करने के लिए सक्षम है. एक साथ संवहनी चौड़ाई को मापने में brightfield माइक्रोस्कोपी (चौड़ाई का उपयोग करके"अदृश्य") ESL और एक नाड़ी ESL से बाहर रखा अनुरेखक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के clusive, ESL मोटाई एक आधा संवहनी 2 चौड़ाई के बीच अंतर के रूप में गणना की जा सकती है.
ESL मोटाई के एक तात्कालिक उपाय उपयोग फुफ्फुसीय glycocalyx के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण है, महत्वपूर्ण फेफड़े और हृदय गति artifact दिया. जबकि हाल के अग्रिमों vivo 12, 13 में माउस फेफड़ों के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देते हैं, चिंताओं फेफड़ों के ठहराव के शारीरिक प्रभाव के बारे में मौजूद हैं. फेफड़े गतिहीनता की कमी हुई endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड, 14 संकेत एक संकेतन मार्ग कि दोनों न्युट्रोफिल आसंजन 15 और 16 चोट फेफड़ों प्रभावों के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, हानिकारक कतरनी बलों (तथाकथित "atelectrauma") मोबाइल alveoli आसपास को उजागर फेफड़ों के एक क्षेत्र के स्थिरीकरण की क्लासिक शारीरिक अवधारणाओं के साथ अनुसार,वायुकोशीय अन्योन्याश्रय 17.
2008 में, Arata Tabuchi, वोल्फगैंग Kuebler और उनके सहयोगियों ने एक शल्य चिकित्सा एक स्वतंत्र रूप से चलती माउस 18 फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति तकनीक विकसित की है. इस तकनीक से उत्पन्न होने वाले श्वसन artifact brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ माप सहित, उच्च गति इमेजिंग के उपयोग द्वारा नकार दिया जा सकता है. इस रिपोर्ट में, हम विस्तार कैसे तात्कालिक dextran अपवर्जन इमेजिंग एक माउस vivo में स्वतंत्र रूप से चलती है, फेफड़ों के subpleural microcirculation में ESL मोटाई मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस तकनीक को आसानी glycocalyx निर्धारित करने के लिए कर सकते हैं समारोह में विशेष रूप से संशोधित, एक ESL बरकरार endothelial सतह से घूम तत्वों को बाहर की क्षमता. हमने हाल ही में इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है 2 पूति जैसे प्रणालीगत भड़काऊ रोगों के दौरान गंभीर फेफड़ों की चोट के विकास के लिए फेफड़े ESL अखंडता के महत्व को निर्धारित करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivo माइक्रोस्कोपी के विस्तार के उपयोग के साथ संपाती, वहाँ दोनों ESL के पर्याप्त आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इसके नाड़ी समारोह के लिए कई योगदान के लिए वृद्धि की सराहना की है. इन उभरते डेटा, तथाप…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस धन्यवाद. Arata Tabuchi और intravital माइक्रोस्कोपी के बारे में निर्देश के लिए वोल्फगैंग Kuebler (टोरंटो विश्वविद्यालय के). हम माइक्रोस्कोपी डिजाइन और कार्यान्वयन में सहायता के लिए एंड्रयू काहिल (Nikon उपकरण) धन्यवाद. यह काम NIH / NHLBI अनुदान P30 HL101295 और K08 HL105538 (ईपीएस) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
Referências
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
