Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse
Summary
Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento liberamente<em> In vivo</em> Polmonare mouse.
Abstract
Il glicocalice endoteliale è uno strato di proteoglicani e glicosaminoglicani associati rivestono il lume vascolare. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che contribuisce al mantenimento della funzione endoteliale. Come il glicocalice endoteliale è spesso aberrante in vitro e si perde durante tecniche standard di fissazione dei tessuti, studio della ESL richiede l'uso di microscopia intravitale. Per meglio approssimare la fisiologia complesso del microcircolo alveolare polmonare immagini intravitale è idealmente eseguita su un polmone liberamente mobile. Tali preparazioni, tuttavia, tipicamente soffrono di artefatti da movimento ampio. Si dimostra come chiuso petto microscopia intravitale di un polmone topo liberamente mobile può essere utilizzato per misurare l'integrità glicocalice con esclusione ESL di fluorescenza destrani marcati ad alto peso molecolare dalla superficie endoteliale. Il mancato recupero tecnica chirurgica, che richiedebrightfield simultanea e imaging fluorescente del polmone mouse, consente l'osservazione longitudinale del microcircolo subpleurica senza evidenza di indurre lesioni confondimento polmonare.
Introduction
Il glicocalice endoteliale è uno strato extracellulare di proteoglicani e glicosaminoglicani associati costeggiano il vascolare intimale. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che regola una varietà di funzioni endoteliali compreso permeabilità di un fluido 1, neutrofili-endoteliale adesione 2, e l'meccanotrasduzione di fluido 3 shear stress.
Storicamente, il glicocalice è stata sottovalutata a causa della sua aberrance in preparazioni di cellule in coltura 4, 5 e la sua degradazione durante il fissaggio del tessuto standard e di elaborazione 6. L'uso sempre più 7 di microscopia intravitale (microscopia in vivo, IVM) ha coinciso con elevato interesse scientifico per l'importanza della ESL di funzione vascolare durante la salute e la malattia. L'ESL è invisibile per microscopia ottica e non può essere facilmente etichettato devivo, data la propensione di fluorescenti glicocalice leganti lectine di provocare agglutinazione RBC 8 e fatale embolia polmonare (osservazioni non pubblicate). Diversi approcci indiretti sono quindi stati sviluppati per dedurre spessore ESL (e, per estensione, l'integrità glicocalice) nei letti vascolari non-movimento, come l'microcirculations cremastere e mesenterici. Queste tecniche comprendono la misurazione delle differenze in circolazione microparticella velocità in funzione della distanza dalla membrana endoteliale (immagine microparticella velocimetria 9) così come la misurazione della esclusione di ingombranti, fluorescenza etichettati marcatori vascolari (ad esempio destrani) dalla superficie endoteliale (tecnica esclusione destrano 10, 11). Di queste tecniche, solo esclusione destrano è in grado di stimare spessore ESL da misurazioni effettuate in un singolo punto nel tempo. Da misurare simultaneamente larghezze vascolari mediante microscopia brightfield (larghezza inclusive del "invisibile" ESL) e microscopia a fluorescenza di un tracciante vascolare escluso dal ESL, spessore ESL può essere calcolato come metà della differenza tra due larghezze vascolari.
L'uso di una misura istantanea di spessore ESL è adatto per lo studio del glicocalice polmonare. Microscopia intravitale del polmone è impegnativo, dato significativo artefatti da movimento polmonare e cardiaca. Mentre recenti progressi permettono di immobilizzazione polmoni topo in vivo 12, 13, esistono preoccupazioni riguardo l'impatto fisiologico di stasi polmonare. Immobilità polmonare è associato con una diminuzione di ossido nitrico endoteliale segnalazione 14, una via di segnalazione che ha un impatto sia l'adesione dei neutrofili 15 e danno polmonare 16. Inoltre, immobilizzazione di una zona di polmone espone circostante alveoli mobili pregiudizievoli per forze di taglio (cosiddetti "atelectrauma"), secondo i concetti classici fisiologicheinterdipendenza alveolare 17.
Nel 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e colleghi hanno sviluppato una tecnica chirurgica che consente per la microscopia intravitale di un polmone del mouse liberamente in movimento 18. Artefatto respiratorio derivanti da questa tecnica può essere negata con l'uso di imaging ad alta velocità, compresa la misurazione simultanea di chiaro e microscopia a fluorescenza. In questo rapporto, dettaglio come istantanea di imaging esclusione destrano può essere impiegato per misurare lo spessore ESL nel microcircolo subpleurica di muoversi liberamente, in vivo polmone mouse. Questa tecnica può essere facilmente modificato per determinare glicocalice funzione-specifico, la capacità di un intatto ESL escludere circolanti elementi dalla superficie endoteliale. Abbiamo recentemente usato queste tecniche per determinare l'importanza di integrità polmonare ESL allo sviluppo di danno polmonare acuto in malattie infiammatorie sistemiche come sepsi 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coincidente con il diffondersi di microscopia in vivo, vi è crescente apprezzamento sia per la notevole entità delle ESL così come i suoi numerosi contributi alla funzione vascolare. Questi dati emergenti, tuttavia, derivano principalmente da studi del sistema vascolare sistemica. In effetti, l'uso di microscopia in vivo nel polmone è tecnicamente impegnativo, dato artefatto significativo movimento polmonare e cardiaca.
Diversi recenti progressi tecnici hanno consen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Università di Toronto) per l'istruzione per quanto riguarda la microscopia intravitale. Ringraziamo Andrew Cahill (Nikon Instruments) per l'assistenza nella progettazione e realizzazione di microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (per EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
Referências
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