Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека
Summary
Разгадать ранних молекулярных механизмов, лежащих в основе рака простаты посвящения, новые и инновационные модели человеческих систем и подходов крайне необходимы. Потенциал предварительного простаты мезенхимы урогенитального синуса (UGSM), чтобы побудить население плюрипотентных стволовых клеток для формирования человеческого эпителия простаты является мощным инструментом в экспериментальном исследовании простаты.
Abstract
Прогресс в исследовании рака простаты строго ограничена наличием человеческого происхождения и гормонов наивные модели систем, которые ограничивают нашу способность понимать генетических и молекулярных событий, лежащих в основе заболевания простаты посвящения. К разработке более эффективных систем моделью для изучения человеческих простаты канцерогенеза, мы и другие воспользовались уникальной Pro-индуктивные простаты потенциал эмбриональных грызунов стромы простаты, называемая мезенхимы урогенитального синуса (UGSM). При рекомбинации с определенными плюрипотентных клеточных популяций, таких как эмбриональные стволовые клетки, UGSM индуцирует образование нормальной человеческой предстательной железы эпителия в тестостерон-зависимым образом. Такая система человека модель может быть использован для исследования и экспериментально проверить способность кандидата гены рака простаты восприимчивость ускоренными темпами по сравнению с типичными исследования трансгенных грызуна. Поскольку человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) могут быть генетически модифицированные культуры в Усинг индуцируемой экспрессии гена или миРНК нокдауна векторов до ткани рекомбинации, такая модель облегчает тестирование функциональных последствий генов или их комбинации генов, которые, как полагают, способствуют или предотвращения канцерогенеза.
Методика выделения чистых популяций UGSM клетки, однако, является сложной задачей и зачастую требует обучения кто-то с предыдущим опытом, чтобы лично учить. Кроме того, прививка клеточных смесей под почечную капсулу с ослабленным иммунитетом хозяина может быть технически сложным. Здесь мы опишем и проиллюстрируем соответствующего уровня изоляции UGSM из эмбрионов грызунов и почечной капсулы имплантации тканей смесями, чтобы сформировать человека эпителия простаты. Такой подход, на современном этапе, в естественных условиях требуется ксенотрансплантации эмбриональных стволовых клеток; будущих приложений потенциально может включать в пробирке образование железы или использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток населения (ИПСК).
Introduction
Существует огромная потребность в более человеческих систем модели рака простаты. В частности, соответствующие системы человека модели нормальным, доброкачественных простаты тканей, которые могут быть генетически манипулировать, чтобы непосредственно различить роль специфических генов в инициации рака предстательной железы, было бы невероятно информативным. Появление геномной эры выявила многочисленные гены, которые могут играть определенную роль в формировании рака. Отсутствие экспериментальных систем организма человека модели, однако, значительно ограничивает наши возможности функционального тестирования и характеризуют кандидата простаты генов предрасположенности к раку. Идеальная модель системы будет способствовать быстрому и более быстрому функциональный анализ генов предрасположенности к раку в сочетании с соответствующими трансгенной системы модели грызунов. Кроме того, такие системы человека модель позволит молекулярной характеристики сигнальных механизмов простаты канцерогенеза в направлении открытия и проверки новых методов лечения, чтобыпредотвратить рак простаты формирования.
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) способны образовывать ткани предстательной железы человека в качестве ксенотрансплантатов. В 2006 Taylor и соавт. Сообщили, что ЭСК могут быть вызваны, чтобы сформировать предстательной железы эпителия в естественных условиях при повторном сочетании с грызунами урогенитального синуса мезенхимы (UGSM) в течение периода времени 8-12 недель. 1 Эти исследования были основаны на предыдущей работе Кунья лаборатории показали, что грызуны эмбриональных UGSM предстательной железы может способствовать дифференциации стволовых клеток и эмбриональных эпителиальных клеточных популяций в естественных условиях. 2,3 простаты развивается из эмбриональных зачатков называется урогенитального синуса (ПХГ), а до 17-й день эмбрионального (мышь E17 ; E18 день у крыс) ПХГ могут быть удалены и физически разделены на эпителий (UGSE) и мезенхимы (UGSM) 4 Этот подход ткани рекомбинации значительно расширил наше понимание развития простаты и канцерогенеза, частности.LY фактора роста и гормональных сигнальных путей и молекулярные связи между простаты стромы и эпителия. 5-8 Этот метод предполагает экс сочетание естественных условиях из стволовых UGSM или эпителиальные клетки из того же или различных видов и этих сотовых / рекомбинантами ткань имплантируют и выращивали и ксенотрансплантата мыши в хосте. 4,9 После периода в естественных условиях роста, имплантат содержит простаты эпителиальных железистых структур встроенных в стромальной ткани. Далее окрашивание может быть проведена для определения того, такие структуры, которые действительно предстательной железы и человеческого происхождения. 10,11
Protocol
Representative Results
Discussion
Ткань рекомбинации с использованием UGSM является чрезвычайно полезным методом исследовать развитие предстательной железы и молекулярных событий, ведущих к инициированию рака предстательной железы. Индуктивный потенциал UGSM была использована для многочисленных приложений в простате…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to acknowledge the support of the University Of Chicago Section Of Urology led by Dr. Arieh Shalhav, and the Director of Urologic Research Dr. Carrie Rinker-Schaeffer. We would also like to acknowledge the support of the University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) led by Dr. Michelle Le Beau. We also with to thank expert technical assistance of the Human Tissue Resource Center core facility led by Dr. Mark Lingen, and the assistance of Leslie Martin and Mary Jo Fekete. We also thank the Immunohistochemistry Core Facility run by Terri Li. This work was funded by the University of Chicago Department of Surgery, the Section of Urology; an American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, #IRG-58-004); a Cancer Center Support Grant (P30 CA14599); The Brinson Foundation; the Alvin Baum Family Fund; The University of Chicago Cancer Research Foundation Women’s Board; S. Kregel is supported by an HHMI: Med-into-Grad Fellowship (56006772) and a Cancer Biology Training Grant (T32-CA09594). Finally, we would like to thank Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan, and Nathan Stadick for their critical evaluation of the manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
Referências
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
