En<em> In vitro</em> Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Summary

Monocytafledte makrofager er vigtige celler i det medfødte immunsystem. Her beskriver vi en nem at bruge<em> In vitro</em> Model til at generere disse celler. Brug gradientcentrifugering, negativ perle isolation og særlige celledyrkningsbetingelser, kan monocytafledte makrofager Der genereres fænotypiske og funktionelle studier.

Abstract

Monocytafledte makrofager udgør en vigtig celletype af det medfødte immunsystem. Musemodeller studerer makrofag biologi lider fænotypiske og funktionelle forskelle mellem murine og humane monocyt-afledte makrofager. Derfor har vi her beskrive en in vitro-model til at generere og studere primære humane makrofager. Kort fortalt, efter densitetsgradientcentrifugering af perifert blod udtaget fra en underarm vene, er monocytter isoleret fra perifere mononukleære celler ved anvendelse af negativ magnetisk perle isolation. Disse monocytter dyrkes derefter i seks dage under særlige betingelser at inducere forskellige typer af makrofag differentiering eller polarisering. Modellen er let at bruge og omgår problemerne med artsspecifikke forskelle mellem mus og menneske. Desuden er det tættere på in vivo end anvendelsen af immortaliserede cellelinier. Konklusionen er, at modellen er beskrevet her er egnet til at studere macrophage biologi, identificere sygdomsmekanismer og nye terapeutiske mål. Selvom ikke fuldt ud erstatte forsøg med dyr eller humane væv opnået post mortem, modellen er beskrevet her tillader identifikation og validering af sygdomsmekanismer og terapeutiske mål, der kan være yderst relevant for forskellige menneskelige sygdomme.

Introduction

Monocytafledte makrofager udgør en vigtig cellulær komponent af det medfødte immunsystem og bidrager til mange akutte eller kroniske inflammatoriske processer ^1.. Makrofager spiller en vigtig rolle i mange inflammatoriske sygdomme som åreforkalkning eller kræft ^2. Makrofager udviser en høj grad af plasticitet og er i stand til at antage forskellige fænotyper afhængigt af den lokale micromilieu ^3.. Således studere makrofag differentiering og heterogenitet er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af ​​mange sygdomme og for at tillade identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye behandlingsformer.

I mange tilfælde er murine modeller anvendt til at undersøge patofysiologien af ​​specifikke sygdomme. Men studerer makrofag biologi hjælp musemodeller ledsaget af flere mangler: (1) Den andel af leukocyt delmængdebetingelser numre (dvs. monocytter og granulocytter) i peripHeral blod af mus eller mennesker adskiller sig væsentligt tyder forskellige roller monocytter i murine og humane patofysiologi. (2) Der er betydelige forskelle i genekspression mellem murine og humane perifere blod monocytter tyder væsentlige forskelle i deres funktion under sundhed og sygdom ^4.. (3) En række markører, der bruges til at identificere murine monocytter og makrofager (F4/80, Lyc osv.) Findes ikke i humane myeloide celler, hvilket gør overførslen af resultater i musemodeller for den menneskelige situation, temmelig vanskelig.

Således, for at øge vores forståelse af makrofag differentiering og forskelligartethed i human sygdom, er vi nødt til at gøre brug af modeller arbejder med humane makrofager. Derfor, vi her beskrive en model af humant primær makrofag generation, er nem at bruge og tillader undersøgelse af humane monocyt-afledte makrofager in vitro under forskellige betingelser resulterer i forskellige makrofag popolarisation typer. I flere studier har vi brugt in vitro model for monocytafledte primære humane makrofager til at analysere makrofag biologi og dens potentielle relevans for human åreforkalkning ^5-7.

Selvom ikke fuldt ud erstatte forsøg med dyr eller humane væv opnået post mortem, modellen er beskrevet her tillader identifikation og validering af sygdomsmekanismer og terapeutiske mål, der kan være yderst relevant for forskellige menneskelige sygdomme.

Protocol

1.. Protokol Forbered Buffere som følger: Forbered buffer for PBMC isolation: "Vask buffer" = 0,02% EDTA i PBS (brug 0,5 M EDTA). Forbered buffer for monocyt isolation: "MACS skyllepuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 ml). Afgasse bufferen. Forbered buffer for FACS-farvning og opbevaring af celler: "FACS buffer" = 10% FCS i PBS og "fiksering buffer" = 1% PFA i PBS. Trække 30 ml fuldblod fra en unde…

Representative Results

Anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, vi rutinemæssigt opnå 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml blod (gennemsnit ± standardafvigelse fra 26 uafhængige forsøg, figur 1A). Monocyt renhed som bestemt ved flowcytometrisk farvning for CD14 er rutinemæssigt større end 95% (97,1 ± 0,4%, gennemsnit ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter, figur 1B). Cellelevedygtighed af frisk isolerede monocytter som bestemt ved trypanblåt-farvning er r…

Discussion

Monocytafledte makrofager repræsenterer den centrale celletype af det medfødte immunsystem. De spiller en vigtig rolle i mange inflammatoriske sygdomme, herunder åreforkalkning eller kræft ^2.. Således studere makrofag biologi er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af ​​mange sygdomme og muliggøre udviklingen af ​​nye behandlingsformer.

Mange undersøgelser gælder for musemodeller overudtrykker eller mangler visse gener af interesse. I tilfælde af mono…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
50 ml centrifuge tube (sterile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
FACS tubes	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
human M-CSF 10 μg	Peprotech	300-25
Cell Culture Plates 6-well	Fisher	07-200-80