Qui vi presentiamo un approccio sistematico per lo sviluppo fisiologicamente rilevanti, sensibile e specifico<em> In vivo</em> Saggi per interpretare variazione nella patologia umana. Manipolazione genetica transitoria tramite microiniezione di WT e mutanti mRNA umano e morpholino (MO) oligonucleotidi antisenso sfruttare la trattabilità del zebrafish embrione in via di sviluppo a rapida mutazioni patogene del test, soprattutto, ma non esclusivamente, nel contesto di disturbi dello sviluppo umano.
Qui vi presentiamo i metodi per lo sviluppo di test per interrogare i cambiamenti non sinonime di potenziale significato clinico utilizzando de complementazione vivo in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) sono un sistema animale utile per la loro trattabilità sperimentale, gli embrioni sono trasparenti per permettere la visualizzazione facile, sottoporsi a sviluppo rapido ex vivo, e possono essere manipolati geneticamente 1 Questi aspetti hanno permesso significativi progressi nell'analisi di embriogenesi,. processi molecolari e morfogenetica segnalazione. Nel loro insieme, i vantaggi di questo modello vertebrato zebrafish rendono altamente suscettibili di modellazione dei difetti dello sviluppo nella malattia pediatrica, e in alcuni casi, disturbi ad insorgenza nell'età adulta. Poiché il genoma zebrafish è altamente conservata con quella degli esseri umani (~ 70% ortologhi), è possibile ricapitolare stati di malattia umani in zebrafish. Questo si realizza sia attraverso l'iniezione di m mutante umanaRNA per indurre dominante negativo o aumento di alleli funzionali, o l'utilizzo di morpholino (MO) oligonucleotidi antisenso per sopprimere i geni per imitare la perdita di varianti di funzione. Attraverso la complementazione dei fenotipi MO indotte con capped mRNA umano, il nostro approccio permette l'interpretazione degli effetti deleteri delle mutazioni sulla sequenza della proteina umana basata sulla capacità di mRNA mutante per salvare un misurabile, fisiologicamente rilevanti fenotipo. Modellazione degli alleli malattia umani avviene tramite microiniezione di embrioni di zebrafish con MO e / o mRNA umano allo stadio delle cellule 1-4, e la fenotipizzazione fino a sette giorni dopo la fecondazione (DPF). Questa strategia generale può essere esteso ad una vasta gamma di fenotipi di malattia, come dimostrato nel seguente protocollo. Vi presentiamo i nostri modelli stabiliti per morfogenetica segnalazione, craniofacciale cardiaco, l'integrità, vascolare, la funzione renale, e scheletrici fenotipi disturbo muscolare, così come gli altri.
L'interpretazione funzionale delle informazioni genetiche e di assegnazione del valore clinico predittivo di un genotipo rappresenta un grave problema in genetica medica e sta diventando sempre più pregnante con l'accelerazione di fattibilità tecnica ed economica di tutto il genoma sequenziamento. Pertanto, è necessario sviluppare e implementare nuovi paradigmi per testare la patogenicità di varianti di significato sconosciuto (VUS) rilevate nei pazienti. Questi test devono quindi essere precisi, nel tempo ed economicamente efficiente, e porto il potenziale per catalizzare una transizione di utilità clinica.
Mentre il mouse è sempre stato lo strumento di scelta nel campo della modellazione malattia umana, zebrafish stanno emergendo come un surrogato scientificamente ed economicamente favorevole. A differenza del topo, biologia zebrafish permette l'accesso facile e tempestivo a tutte le fasi di sviluppo, aiutati dalla chiarezza ottica di embrioni che consente l'imaging in tempo reale di sviluppo patologie. <sup> 1 La relativamente recente generazione di linee mutanti di zebrafish ha fornito ulteriori test e opzioni di modellazione, impiegato da molti in studi funzionali, ma questa tecnologia continua ad essere limitato (recensione a 1,38). Non solo i mutanti genetici con knock-in di mutazioni specifiche faticosi da raggiungere, anche questi non sono suscettibili di un'analisi di medio o high-throughput per la sperimentazione di una serie di mutazioni in un singolo gene. Importante, un'unica suite di test può fornire informazioni non solo per il potenziale patogeno di alleli, ma anche per la direzione dell'effetto a livello cellulare (ad es perdita di funzione vs guadagno di funzione), che è critica per la modalità di ereditarietà informare nelle famiglie, specialmente quando i piccoli alberi genealogici umani nutrono scarse informazioni sulle modalità di trasmissione genetica. Per ulteriore confronto degli usi di modelli disponibili zebrafish mouse e, vedi Tabella 1.
Notiamo anche che lari sono limitazioni intrinseche al sistema modello di zebrafish. Sebbene D. rerio ha un rapido sviluppo iniziale dei sistemi di organi, la maturità sessuale richiede circa tre mesi. A causa di questo, disturbi prenatale e pediatrica insorgenza sono i più adatti a questo modello di espressione transiente. Mentre ideale per condurre grandi schermi composti chimici, l'uso di mutanti genetici non è fattibile per il test sistematico di migliaia di varianti nonsynonymous che contribuiscono, e continuano ad essere rilevato in disturbi pediatrici.
I test di complementazione qui descritti approfittare di questa trattabilità sperimentale, alto grado di omologia, e la conservazione della funzione tra proteine umane e zebrafish, in modo particolare per le molecole necessarie per i processi di sviluppo conservati. Figura 1 illustra la sperimentazione e la strategia di identificazione per i vari effetti allele. Sia perdita di funzione (OL) e saggi dominanti possono essere eseguite. Per LOF, l'esperimento ha inizio con la soppressione del gene di interesse con un atterramento morpholino, e del test per i fenotipi che potrebbero essere rilevanti per il fenotipo clinico in esame. Soppressione può essere ottenuto sia bloccando traduzione di mira una MO o in prossimità del sito di inizio della traduzione del pesce zebra locus (traduzione bloccante morpholino; tbMO) o interferendo con splicing mettendo un MO su un nodo di giunzione, tipicamente inducendo o inserimento di un introne o exon skipping aberrante (giuntura blocco morpholino; SBMO).
Successivamente, mRNA ricoperto dalla trascrizione umano orthologous è introdotto e soccorso quantificabile del fenotipo è misurata. Una volta che il test è stabilita, mutazioni candidati nel messaggio umano possono essere introdotti ed analizzati per la loro capacità di salvare il fenotipo MO indotta presso la stessa efficienza di WT mRNA umano. Al contrario, per il candidato alleli dominanti, mRNA umano (ma non MO) è introndr con l'aspettativa che WT mRNA umano non sarà grossolanamente influenzare zebrafish anatomia e fisiologia, che, l'introduzione di mutazioni di prova che hanno un effetto dominante sarà indurre fenotipi analoghi a quelli osservati nella condizione clinica umana. Questo esperimento può essere a grana fine di sezionare ulteriormente se l'effetto dominante si verifica da un guadagno di funzione (GOF) o un meccanismo dominante negativo dal taglio di WT e mutante mRNA umano, per gli eventi GOF, aggiunta di WT mRNA umano dovrebbe essere irrilevante, mentre per gli alleli dominanti negative, la miscelazione di mRNA WT e mutanti dovrebbe alterare la gravità del fenotipo indotto dal messaggio mutante. In tutti i casi, si consiglia di tutte le combinazioni di iniezioni (MO con WT mRNA umano vs morpholino con mRNA umano mutante ecc essere effettuata, preferibilmente entro la stessa frizione di embrioni (vedi Figura 1) L'interpretazione è la seguente.:
Per le prove di LOF:
Per i test dominanti:
Piano di emergenza:
I metodi qui descritti rappresentano un protocollo generale applicabile al dosaggio dei cambiamenti nonsynonymous associate con una varietà di fenotipi malattia genetica umana (Tabella 2, Figura 3). I nostri approcci si sono dimostrati utili per valutare il potenziale impatto di variazione su fenotipi di malattia, e per contribuire a sviscerare i meccanismi della malattia (come il contributo delle mutazioni dominanti negative per la sindrome di Bardet-Biedl, un disordine autosomico recessivo soprattutto 17). Ad oggi, attraverso lo sviluppo dell'albero decisionale presentato, abbiamo modellato al costo e di tempo ragionevole al di sopra di 200 geni causalmente connessi con malattie genetiche, ad un eccesso di 1.000 alleli.
Anche se non è discusso in dettaglio qui, abbiamo anche dimostrato che questi metodi sono appropriati per modellare altri tipi di lesioni genetiche, come il numero di copie (CNV varianti) e di genetica e interazioni. Le analisi di questi eventi sono al di là del campo di applicazione delmetodo della presente descrizione, pur fondamentalmente basano sullo stesso principio di test sistematici di geni candidati (incluse coppie di geni iniettati contemporaneamente) per determinare induzione o esacerbazione di fenotipi clinicamente appropriate. Ad esempio, per chiarire che dei 29 geni nel 16p11.2 CNV potrebbe essere rilevante per l'osservato microcefalia osservata nei pazienti con duplicazioni di 660 kb segmento genomico, mRNA corrispondente a ciascuno dei 29 geni all'interno del segmento sono stati iniettati e la testa misurazione delle dimensioni sono stati condotti a 2 dpf e 5 dpf, rivelando un importante contributo di un singolo trascritto, KCTD13 21. Inoltre, abbiamo utilizzato questo modello per analisi interazioni genetiche di lesioni genomiche in pazienti con entrambi sindrome di Bardet-Biedl e malattia di Hirschsprung. 22 Al confronto di MO soppressione dei geni causali delle due identità clinici separatamente e contemporaneamente, siamo stati in grado di identificare il fenotipo risultante da being una interazione sinergica piuttosto che semplicemente additivo gravità.
Pur avendo stabilito alta sensibilità (98%) e specificità (> 82%) per le varianti che contribuiscono al ciliopathies 17, noi non abbiamo ancora dati sufficienti per determinare se questi sono generalizzabili a tutte le letture fenotipiche nei modelli di zebrafish. Per fare ciò, un gran numero di alleli, predisse geneticamente per essere benigni o patogeni, deve essere testato all'interno di ciascuna categoria fenotipica. Ciò sarà particolarmente importante per l'attuazione di tali dosaggi nel setting clinico, in cui interpretazione funzionale VUSs può informare la diagnosi e la gestione solo se una conoscenza solida di falsi positivi e falsi negativi può accompagnare la consegna di tali risultati ai medici e pazienti. Tuttavia, questi metodi possono contribuire significativamente verso una migliore comprensione del paesaggio di malattia genetica umana. Prevediamo che questi modelli non serviranno solo come fonzione per una migliore interpretazione delle informazioni genetiche cliniche, ma anche essere impiegato come modelli utili per condurre schermate terapeutiche. I dati in vivo può anche essere paragonato al silico predizioni computazionali da fonti come PolyPhen 23, setacciare 24 SNPs & GO 25, o MutPred 26 per mostrare concordanza. Si noti che in un precedente studio di previsione database SNP & GO e MutPred sono risultati essere il più preciso, con precisioni di solo 0,82 e 0,81 raggiungendo, rispettivamente 27.
Anche se abbiamo delineato la robustezza di questi metodi per un sottoinsieme di difetti anatomici pediatrici (Tabella 2, Figura 3), certi fenotipi sono meno trattabili con questi metodi. Alcune eccezioni nonostante, ci sono tre classi principali di disturbi non riconducibili al nostro protocollo. Disturbi ad insorgenza nell'età adulta (come il morbo di Parkinson), rappresentano una sfida al modello in un sistema embrionale. Lento progression fenotipi degenerative (come la demenza frontotemporale) possono richiedere più tempo di quanto la finestra dpf sette delle attività MO per produrre un fenotipo. Altre tecnologie knockdown gene come RNAi e siRNA sono a disposizione per interferire o degradare il gene bersaglio, ma è stato dimostrato che nessuno è così specifica, stabile, non tossico, o di lunga durata, come MOs 28, quindi anche limitando il periodo di tempo per fenotipizzazione. Terzo, alcune strutture vertebrati, come il polmone di mammifero, non hanno una struttura sufficientemente ortologhi nell'embrione zebrafish. Abbiamo anche fornito un piano di emergenza suggerito per le indagini di quei casi in cui WT iniezione di mRNA umano porta ad un fenotipo, anche se avvertiamo questa è una situazione insolita e indesiderabile.
Alcuni fenotipi malattia possono quindi richiedere un maggior grado di astrazione e la maternità surrogata. E 'possibile che la funzione del gene è discostato sufficientemente per indebolire la somiglianza fenotipica tra modello e true fenotipo, o che zebrafish fisiologia complica inerentemente gli effetti della malattia indotta. In questi casi, si consiglia ulteriore dissezione del fenotipo prodotto prima licenziamento. Abbiamo prodotto alcuni esempi di successo in cui fenotipi problematiche per questo saggio sono stati modellati in embrioni di zebrafish. Per esempio, mutazioni in TCF8 un gene associato Fuchs distrofia corneale (FCD) sono stati analizzati utilizzando il nostro protocollo utilizzando difetti gastrulazione come visualizzatore fenotipica surrogato base ai ruoli noti di questo trascritto nel primo sviluppo. 29 In altri casi, come ad come adulto-inizio distrofia muscolare causata da mutazioni in DNAJB6, siamo stati in grado di generare fenotipi miofibre in embrioni 5dpf nonostante il fatto che gli esseri umani sono privi di patologia muscolare apprezzabile nei loro primi tre o quattro decenni di vita 19.
Oltre ai modelli mutanti transitori presentati qui, altri hanno preso advantage di questo sistema transitorio per modellare malattia umana in una varietà di sistemi del corpo. In un esempio, retinite pigmentosa stato modellato in zebrafish dal knockdown del gene RP2, con conseguente morte delle cellule retiniche e diminuita laminazione retinica. Salvataggio con mRNA wild-type umana ha portato allo sviluppo di tutti e tre strati di laminazione retinica, mentre quattro su cinque mRNA mutanti riuscito a salvare. 30 Anche tale modello di un disturbo sensoriale umano è basato su un fenotipo morfologico, è anche possibile risposta saggio a stimoli come stimoli acustici o prepulse inibizione 47.
Recentemente, un modello di zebrafish è stato utilizzato per studiare la malattia di Alzheimer attraverso la patogenesi proteina precursore dell'amiloide. 31 Gli autori hanno dimostrato che knockdown gene causato alterata crescita degli assoni dei neuroni motori, che potrebbero essere salvati con mRNA umano. Questo modello ha dimostrato di essere particolarmente informativo, come i modelli del mouse visualizzano solo phenot sottileipi (singolo atterramento) o letalità postnatale (doppio atterramento). La capacità di valutare gli embrioni di zebrafish in vivo durante tutto lo sviluppo ha aiutato a discernere l'effetto patogeno di ridotta proteina precursore dell'amiloide, così come previsto prova diretta che la proteina richiede sia un dominio extracellulare e intracellulare per il corretto funzionamento. Altri modelli importanti sono quella di altre distrofie muscolari 32, Diamante Blackfan 33, Axenfeld-Reiger sindrome (sviluppo oculare e cranio-facciale) 34, la malattia infiammatoria intestinale 35 (attività antibatterica), malattia di Parkinson 36 (neurone e la perdita di locomozione), e il sequestro 37 (idrocefalo e iperattività).
Più comuni sono le linee di zebrafish mutanti che hanno dimostrato anche di ricapitolare un fenotipo malattia umana. Inviato a 1,38, i modelli includono la leucemia, il melanoma, cardiomiopatie dilatate, la distrofia muscolare di Duchenne,e molti altri.
The authors have nothing to disclose.
Noi riconosciamo il sostegno di una della Duke University Dean Estate Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) fellowship 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01-EY021872 dal National Eye Institute (EED), R01HD04260 dal Istituto Nazionale della Salute dei bambini e lo sviluppo (NK), R01DK072301 e R01DK075972 dal National Institute of Diabetes Digestiva e Malattie renali (NK), e l'Unione europea (finanziato da UE 7 ° PQ sotto GA nr 241955, progetto SYSCILIA,. EED, NK) NK è un Distinguished Jean e George W. Brumley prof.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |