A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y específico<em> In vivo</em> Ensayos para interpretar la variación en la patología humana. Manipulación genética transitoria a través de la microinyección de WT y mutante ARNm humano y morfolino (MO) oligonucleótidos antisentido aprovechar la trazabilidad del embrión de pez cebra en desarrollo para rápidamente mutaciones patógenas de ensayo, especialmente, pero no exclusivamente, en el contexto de trastornos del desarrollo humanos.
A continuación, presentamos los métodos para el desarrollo de ensayos para consultar nonsynonymous cambios potencial y clínicamente significativos utilizando pt complementación vivo en el pez cebra. El pez cebra (Danio rerio) son un sistema de animal útil debido a su tratabilidad experimental; embriones son transparentes para permitir la visualización fácil, rápido desarrollo someterse a ex vivo, y se pueden manipular genéticamente 1 Estos aspectos han permitido avances significativos en el análisis de la embriogénesis,. procesos moleculares, y morfogenética de señalización. Tomados en conjunto, las ventajas de este modelo de pez cebra vertebrado hacen altamente susceptibles a la modelización de los defectos de desarrollo en la enfermedad pediátrica, y en algunos casos, los trastornos de inicio adulto. Debido a que el genoma pez cebra está altamente conservada con la de los seres humanos (~ 70% ortólogos), es posible recapitular estados de enfermedad humanos en el pez cebra. Esto se logra ya sea a través de la inyección de m mutante humanaARN para inducir el aumento de dominante negativo o de los alelos de función o la utilización de morpholino (MO) oligonucleótidos antisentido para suprimir genes para imitar la pérdida de función de las variantes. A través de la complementación de fenotipos MO inducidas con ARNm humano capsulado, nuestro enfoque permite la interpretación de los efectos perjudiciales de las mutaciones en la secuencia de la proteína humana sobre la base de la capacidad de ARNm mutante para rescatar a un medible, fenotipo fisiológicamente relevante. Modelado de los alelos de enfermedad humana se produce por medio de microinyección de embriones de pez cebra con MO y / o ARNm humano en la etapa de células 1-4 y fenotípicos hasta siete días después de la fertilización (dpf). Esta estrategia general se puede extender a una amplia gama de fenotipos de la enfermedad, como se demuestra en el siguiente protocolo. Presentamos nuestros modelos establecidos para morfogenética de señalización, la integridad craneofacial, cardiaca, vascular, la función renal, y del músculo esquelético fenotipos trastorno, así como otros.
La interpretación funcional de la información genética y la asignación del valor clínico predictivo para un genotipo representa un problema importante en genética médica y se está convirtiendo cada vez más punzante con la aceleración de la viabilidad técnica y económica de la secuenciación de todo el genoma. Por lo tanto, es necesario desarrollar y poner en práctica nuevos paradigmas para probar la patogenicidad de las variantes de significado desconocido (VUS) detectados en los pacientes. Estos ensayos deben entonces ser exacta, el tiempo-y rentable, y el puerto el potencial para catalizar una transición a la utilidad clínica.
Mientras que el ratón ha sido tradicionalmente la herramienta de elección en el campo de la modelización de enfermedades humanas, el pez cebra se perfila como sustituto científica y económicamente favorable. A diferencia del ratón, la biología pez cebra permite el acceso fácil y oportuno a todas las etapas de desarrollo, ayudados por la claridad óptica de embriones que permite la formación de imágenes en tiempo real de patologías en desarrollo. <sup> 1 El relativamente reciente generación de líneas de pez cebra mutante ha proporcionado pruebas adicionales y opciones de modelado, empleado por muchos en los estudios funcionales, pero esta tecnología sigue siendo limitada (revisado en 1,38). No sólo son mutantes genéticos con knock-ins de mutaciones específicas laboriosas para alcanzar, también son no susceptibles de análisis a medio o de alto rendimiento para el ensayo de una amplia gama de mutaciones en un solo gen. Es importante destacar que, un único conjunto de pruebas puede proporcionar información no sólo para el potencial patógeno de alelos, sino también para la dirección del efecto en el nivel celular (por ejemplo, pérdida de la función vs ganancia de función), lo cual es crítico para el modo de herencia informar en las familias, especialmente cuando pequeñas genealogías humanos albergan información limitada sobre el modo de transmisión genética. Para comparación adicional de los usos de los modelos de ratón y pez cebra disponibles, véase la Tabla 1.
También tomamos nota de que elre limitaciones inherentes al sistema de modelo de pez cebra. Aunque D. rerio tiene un rápido desarrollo inicial de los sistemas de órganos, la madurez sexual requiere de aproximadamente tres meses. Debido a esto, los trastornos prenatales y pediátricos de aparición son los más susceptibles a este modelo de expresión transitoria. Mientras ideal para la realización de grandes pantallas de compuestos químicos, el uso de mutantes genéticos no es factible para la prueba sistemática de miles de variantes no sinónimas que contribuyen a, y continuar para ser detectados en los trastornos pediátricos.
Los ensayos de complementación describen aquí tomar ventaja de esta tratabilidad experimental, alto grado de homología, y la preservación de la función entre las proteínas humanas y pez cebra, sobre todo por lo que para moléculas necesarias para los procesos de desarrollo conservadas. Figura 1 resume la estrategia de identificación de ensayos y de varios efectos alelo. Tanto la pérdida de la función (LOF) y ensayos dominantes se pueden realizar. Para LOF, el experimento se inicia con la supresión del gen de interés con una caída morfolino, y ensayando para fenotipos que pueden ser relevantes para el fenotipo clínico bajo investigación. Supresión se puede lograr ya sea mediante el bloqueo de la traducción por dirigidas a un MO en o cerca del sitio de inicio de la traducción del locus de pez cebra (traducción bloqueador de morfolino; tbMO) o al interferir con corte y empalme mediante la colocación de un MO en un nudo de empalme, típicamente inducir bien a la inclusión de un intrón o exón aberrante saltar (empalme de bloqueo morpholino; SBMO).
Posteriormente, ARNm capsulado de la transcripción ortólogos humanos se introduce y cuantificable rescate del fenotipo se mide. Una vez que se estableció el ensayo, las mutaciones candidatos en el mensaje humano pueden ser introducidos y se ensayaron para su capacidad de rescatar el fenotipo MO-inducida en la misma eficiencia que WT ARNm humano. Por el contrario, para el candidato alelos dominantes, ARNm humano (pero no MO) es de introduccióned con la expectativa de que el ARNm humano WT no afectará gravemente pez cebra anatomía y la fisiología, mientras que la introducción de mutaciones de prueba que tengan un efecto dominante induce fenotipos análogos a los observados en la condición clínica humana. Este experimento puede ser de grano fino para diseccionar aún más si el efecto dominante se produce por una ganancia de función (GOF) o un mecanismo dominante negativo mediante la mezcla de WT y mutante ARNm humano; para eventos GOF, además de ARNm humano WT se espera que sea irrelevante, mientras que para los alelos dominantes negativos, mezcla de ARNm WT y mutante debería alterar la gravedad del fenotipo mutante inducida por el mensaje. En todos los casos, se recomienda que todas las combinaciones de inyecciones (MO con WT ARNm humanos vs morfolino con mutante ARNm humanos, etc realizarse, de preferencia dentro de la misma nidada de embriones (ver Figura 1) La interpretación es la siguiente.:
Para las pruebas de LOF:
Para las pruebas dominantes:
Plan de contingencia:
Los métodos descritos aquí representan un protocolo general aplicable a la determinación de los cambios no sinónimos asociados con una variedad de fenotipos de la enfermedad genéticos humanos (Tabla 2, Figura 3). Nuestros métodos han demostrado ser útiles para evaluar el impacto potencial de la variación de fenotipos de la enfermedad, y para ayudar a diseccionar los mecanismos de la enfermedad (por ejemplo, la contribución de las mutaciones dominantes negativas para el síndrome de Bardet-Biedl, un trastorno autosómico recesivo, principalmente 17). Hasta la fecha, a través del desarrollo del árbol de decisión presentado, hemos modelado a un costo razonable y el tiempo en exceso de 200 genes causalmente asociados con los trastornos genéticos, a un exceso de alelos de 1000.
Aunque no se discute en detalle aquí, también hemos demostrado que estos métodos son apropiados para modelar otros tipos de lesiones genéticas, tales como variantes del número de copia (CNV), así como las interacciones y genética. Los análisis de este tipo de eventos están más allá del alcance demétodo de la presente descripción, a pesar de que fundamentalmente se basan en el mismo principio de la prueba sistemática de genes candidatos (incluyendo pares de genes inyectados al mismo tiempo) para determinar la inducción o exacerbación de fenotipos clínicamente apropiadas. Por ejemplo, para dilucidar cuál de los 29 genes en el 16p11.2 CNV podría ser relevante para la microcefalia observada observado en pacientes con la duplicación de un segmento genómico de 660 kb, ARNm correspondientes a cada uno de los 29 genes en el segmento de la cabeza y se inyectaron las mediciones de tamaño se realizaron a 2 dpf y 5 dpf, revelando una importante contribución de un único transcrito, KCTD13. 21 Además, hemos utilizado este modelo para las interacciones genéticas de ensayo de lesiones genómicas en pacientes tanto con síndrome de Bardet-Biedl y la enfermedad de Hirschsprung. 22 Por comparación de MO supresión de los genes causales de las dos identidades clínicos por separado y al mismo tiempo, hemos sido capaces de identificar el fenotipo resultante como being una interacción sinérgica en lugar de simplemente la gravedad aditivo.
A pesar de haber establecido una alta sensibilidad (98%) y especificidad (> 82%) para las variantes que contribuyen a ciliopatías 17, aún no disponemos de datos suficientes para determinar si son generalizables a todas las lecturas fenotípicas en los modelos de pez cebra. Para ello, un gran número de alelos, predijo genéticamente para ser benignos o patógenos, deben ser a prueba dentro de cada categoría fenotípica. Esto será particularmente importante para la aplicación de dichos ensayos en el ámbito clínico, en el que la interpretación funcional de VUSs puede informar diagnóstico y manejo sólo si una comprensión sólida de falsos positivos y falsos negativos puede acompañar a la entrega de estos resultados a los médicos y pacientes. No obstante, estos métodos pueden contribuir significativamente a una mejor comprensión del paisaje de la enfermedad genética humana. Anticipamos que estos modelos no sólo servirán de fundacionesdación para una mejor interpretación de la información genética clínica, pero también se emplea como modelos útiles para llevar a cabo pantallas terapéuticos. Los datos in vivo también puede ser comparado con in silico predicciones computacionales de fuentes tales como PolyPhen 23, estancos a 24, SNP y GO 25, o MutPred 26 para mostrar la concordancia. Tenga en cuenta que en un estudio anterior de la predicción de las bases de datos de SNPs y GO y MutPred resultaron ser los más precisos, con precisiones alcanzando sólo 0,82 y 0,81, respectivamente. 27
Aunque hemos descrito la robustez de estos métodos para un subconjunto de defectos anatómicos pediátricos (Tabla 2, Figura 3), ciertos fenotipos son menos manejables por estos métodos. Algunas excepciones pesar de ello, hay tres clases principales de trastornos no susceptibles de nuestro protocolo. Trastornos de aparición en adultos (tales como la enfermedad de Parkinson) representan un reto al modelo en un sistema embrionario. Lento progfenotipos degenerativos resión (tales como la demencia frontotemporal) pueden requerir más tiempo que la ventana dpf siete de actividad MO para producir un fenotipo. Otras tecnologías desmontables de genes tales como ARNi y ARNsi están disponibles para interferir con o degradar el gen diana, pero se ha demostrado que ninguno es tan específica, estable, no tóxico, o de larga duración como OMs 28, por tanto, también la limitación del periodo de tiempo de fenotipo. En tercer lugar, algunas estructuras de vertebrados, como el pulmón de mamíferos, no tienen una estructura lo suficientemente ortólogos en el embrión de pez cebra. También hemos proporcionado un plan de contingencia propuesto para la investigación de los casos en que la inyección de ARNm humano WT conduce a un fenotipo, aunque advertimos esto es una situación inusual e indeseable.
Algunos fenotipos de la enfermedad pueden entonces requerir un mayor grado de abstracción y subrogación. Es posible que la función del gen se ha alejado lo suficiente como para debilitar la similitud fenotípica entre el modelo y true fenotipo, o que el pez cebra fisiología complica inherentemente los efectos de la enfermedad inducida. En estos casos, se sugiere una nueva disección del fenotipo producido antes de la salida. Hemos dado algunos ejemplos de éxito en el que los fenotipos problemáticas de este ensayo han sido modelados en embriones de pez cebra. Por ejemplo, las mutaciones en TCF8, un gen asociado con distrofia de Fuchs córnea (FCD), se analizaron utilizando el protocolo mediante el uso de defectos gastrulación como una lectura fenotípica sustituto basado en las funciones conocidas de esta transcripción en el desarrollo temprano. 29 En otros casos, tales como la distrofia muscular adulta causada por mutaciones en DNAJB6, hemos sido capaces de generar fenotipos miofibrilar en embriones 5dpf a pesar del hecho de que los seres humanos son privados de la patología muscular apreciable en sus primeros tres a cuatro décadas de la vida. 19
Además de los modelos mutantes transitorios que se presentan aquí, otros también han Advantage de este sistema transitorio para modelar la enfermedad humana en una variedad de sistemas del cuerpo. En un ejemplo, la retinitis pigmentosa se modeló en el pez cebra por la caída de la RP2 gen, lo que resulta en la muerte celular retiniana y la disminución de la laminación de retina. Rescate con el ARNm humano de tipo salvaje dio como resultado en el desarrollo de todas las tres capas de laminación de la retina, mientras que cuatro de cada cinco ARNm mutantes no pudieron rescatar. 30 Aunque este modelo de un trastorno sensorial humana se basa en un fenotipo morfológico, también es posible ensayo de respuesta a los estímulos tales como sobresalto acústico o la inhibición prepulso. 47
Recientemente, se ha utilizado un modelo de pez cebra para investigar la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer a través de la proteína precursora de amiloide. 31 Los autores mostraron que el gen desmontables causada deteriorado crecimiento de los axones de las neuronas motoras, lo que podría ser rescatados con ARNm humano. Este modelo ha demostrado ser especialmente informativo, como los modelos de ratón sólo se muestran phenot sutilipos (simple caída) o letalidad postnatal (doble caída). La capacidad para evaluar los embriones de pez cebra en vivo durante todo el desarrollo ayudó a discernir el efecto patógeno de la reducción de la proteína precursora de amiloide, así como la evidencia directa, siempre que la proteína requiere tanto un dominio extracelular y el intracelular para la función apropiada. Otros modelos notables incluyen el de distrofias musculares adicionales 32, Diamond Blackfan anemia 33, síndrome Axenfeld-Reiger (desarrollo ocular y craneofacial) 34, la enfermedad inflamatoria intestinal 35 (actividad antibacteriana), la enfermedad de Parkinson 36 (neurona y la pérdida de la locomoción), y la incautación 37 (hidrocefalia e hiperactividad).
Más comunes son las líneas de pez cebra mutantes que se han demostrado también para recapitular un fenotipo de la enfermedad humana. Opinión de 1,38, los modelos incluyen la leucemia, melanoma, miocardiopatías dilatadas, la distrofia muscular de Duchenne,y muchos otros.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos el apoyo de la beca a la Universidad de Dean Duke Verano de Investigación (AN), la Asociación Americana del Corazón (AHA) beca 11POST7160006 (CG), los Institutos Nacionales de Salud (NIH) subvenciones R01-EY021872 del Instituto Nacional del Ojo (EED), R01HD04260 del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo (NK), R01DK072301 y R01DK075972 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas Riñón (NK), y la Unión Europea (Financiado por la UE 7 º PM con AG n ° 241955, proyecto SYSCILIA;. EED, NK) NK es un distinguido Jean y George W. Brumley profesor.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |