में neurodegenerative phenotypes का आकलन<em> ड्रोसोफिला</em> घुस Assays के द्वारा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और पूरे मस्तिष्क Immunostaining

Summary

यहाँ हम में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स की उम्र पर निर्भर neurodegeneration के अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है कि दो assays का वर्णन<em> ड्रोसोफिला</em>: चढ़ाई / डीए न्यूरॉन्स के अध: पतन और पूरे दिमाग आरोह में डीए न्यूरॉन्स की पहचान और गिनती करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो tyrosine hydroxylase immunostaining के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है जो डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis परख.

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर तंत्रिका तंत्र में उम्र बढ़ने और रोग अपक्षयी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है. एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में उड़ान भरने का लाभ अपने आनुवंशिक शिक्षणीयता, लघु जीवन काल और निरीक्षण और मात्रात्मक जटिल व्यवहार का विश्लेषण करने की संभावना भी शामिल है. ड्रोसोफिला मस्तिष्क के विशिष्ट neuronal आबादी में बीमारी से जुड़ी जीनों की अभिव्यक्ति, पार्किंसंस और अल्जाइमर के रूप में ⁵ मानव neurodegenerative रोगों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स उम्र बढ़ने मानव मस्तिष्क में सबसे कमजोर neuronal आबादी के बीच में हैं. पार्किंसंस रोग में (पीडी), सबसे आम neurodegenerative आंदोलन विकार, डीए न्यूरॉन्स के त्वरित नुकसान हरकत समारोह में एक प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय गिरावट की ओर जाता है. उम्र और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के संपर्क के अलावा, महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स की हानि कोडिंग में विशिष्ट परिवर्तन द्वारा exacerbated हैकई जीनों की या प्रमोटर क्षेत्रों. ऐसे पीडी जुड़े alleles की पहचान विवो में डीए न्यूरॉन्स की neurodegeneration के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला के उपयोग के लिए प्रायोगिक आधार प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला डीए न्यूरॉन्स स्मरण दिलाता मानव रोग की कुछ सुविधाओं, डीए न्यूरॉन्स की जैसे प्रगतिशील हानि और गिरावट हरकत समारोह ² में पीडी से जुड़े मानव α-synuclein जीन की अभिव्यक्ति. तदनुसार, इस मॉडल को सफलतापूर्वक पीडी ⁸ में संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

पूरे वयस्क मस्तिष्क की डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis प्रतिक्रिया और tyrosine hydroxylase immunostaining के आधार पर एक चढ़ाई परख डीए न्यूरॉन्स की संख्या पर नजर रखने के लिए mounts: यहाँ हम सामान्यतः ड्रोसोफिला में डीए न्यूरॉन्स की उम्र पर निर्भर neurodegeneration के अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि दो assays का वर्णन अलग अलग उम्र में. दोनों ही मामलों में, यूएएस टी के vivo अभिव्यक्ति मेंडीए न्यूरॉन्स में विशेष रूप से ransgenes एक tyrosine hydroxylase (HI) प्रमोटर-Gal4 चालक लाइन ^{3, 10} का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.

Introduction

यहाँ वर्णित assays की विशिष्टता डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स ³ में विशिष्ट अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए tyrosine hydroxylase जीन की विनियामक दृश्यों कारनामे जो एक Gal4 मक्खी लाइन के उपयोग पर निर्भर करता है. Tyrosine hydroxylase डोपामाइन संश्लेषण में पहला और दर सीमित कदम catalyses. Vivo में डीए न्यूरॉन्स (उदाहरण ⁶ देखें) की पहचान करने के लिए एक अच्छे उम्मीदवार वें बनाने डोपामाइन की कि, साथ वयस्क मक्खी मस्तिष्क ओव्हरलॅप में वें immunoreactivity. इसके अलावा, THGal4 की अभिव्यक्ति पैटर्न रासायनिक पदार्थ decarboxylase जीन से विनियामक दृश्यों में शामिल है और डीए न्यूरॉन्स में न केवल ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति ड्राइव जो ऐसे DdcGal4 के रूप में अन्य Gal4 लाइनों, की तुलना में अधिक विशिष्ट है, लेकिन यह भी ³ glial कोशिकाओं की serotoninergic न्यूरॉन्स और सबसेट में .

Feany और शराबी (2000) पहली पीडी से जुड़े मानव α-synuclein जीन की अखिल neuronal अभिव्यक्ति स्टेशन के प्रगतिशील हानि accelerates कि मनायाड्रोसोफिला में rtle प्रेरित नकारात्मक geotaxis व्यवहार. हम expressionof एक α-synuclein transgene ¹⁰ ड्राइव करने के लिए डीए न्यूरॉन विशिष्ट THGal4 लाइन का उपयोग इसी तरह के परिणाम मनाया और इस में NRF2 मार्ग के neuroprotective भूमिका का अध्ययन करने के लिए यह कार्यात्मक पढ़ने के लिए बाहर का इस्तेमाल किया है पीडी ¹⁴ की ड्रोसोफिला मॉडल. यहाँ वर्णित विशिष्ट परख ² और ³ से अनुकूलित है.

ड्रोसोफिला मस्तिष्क (उदाहरण के ¹¹ और ⁷ के लिए देखें) confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरे मस्तिष्क आरोह में देखे जा सकते हैं जो कम से कम 5 अलग अलग समूहों में व्यवस्था की 100 से अधिक डीए न्यूरॉन्स, (PPL1, PPL2, पाल, PPM1 / 2, PPM3) शामिल हैं. हालांकि, उम्र पर निर्भर neurodegeneration के पीडी से जुड़े जीन उत्परिवर्तित गया है जहां मक्खियों में मनाया / मानव रोगों मॉडल के overexpressed है, यह उम्र ^{9, 11} के साथ ड्रोसोफिला मस्तिष्क गिरावट में डीए न्यूरॉन्स की संख्या है या नहीं, अभी भी विवादास्पद है5. डीए न्यूरॉन्स में मानव α-synuclein का अभिव्यक्ति ऐसी एक प्रभाव है और, इसलिए, पीडी के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हम डीए न्यूरॉन्स एक सेल मार्कर के रूप में वें का उपयोग कर माउंट पूरे मस्तिष्क में गिनती के लिए एक परख का वर्णन है. यह परख ¹³ और ¹⁰ से रूपांतरित किया गया है.

Protocol

1. डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis परख वांछित जीनोटाइप की मक्खियों का चयन करें, उन्हें 20-30 पशुओं के साथियों में समूह बेतरतीब ढंग से, लिंग के आधार पर उन्हें अलग और हर 2-3 दिन नए खाद्य शीशियों में उन्हें फ्लिप…

Representative Results

हम assays के पीडी 14 की एक ड्रोसोफिला मॉडल में तनाव सुरक्षात्मक NRF2 मार्ग की भूमिका का अध्ययन करने के लिए यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है. यह मॉडल एक वें Gal4 चालक 2, 10 का उपयोग करते हुए डीए न्यूरॉन्स में…

Discussion

assays के विभिन्न रोग से जुड़े आनुवंशिक पृष्ठभूमि ⁽⁵ में समीक्षा) में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने में डीए न्यूरॉन्स के रखरखाव में रास्ते या छोटे यौगिकों संकेत, विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करन?…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.