Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.
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Artigo de método
O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma técnica ex vivo para a imagem do mouse epitélio das vias aéreas para a análise quantitativa da função dos cílios móveis importante para a introspecção em função de transporte mucociliar foi estabelecida. Recém-colhida rato traquéia é cortado longitudinalmente através do músculo traqueal e montado em uma câmara com paredes rasas em um prato de vidro de fundo. A amostra de traqueia é posicionado ao longo do seu eixo longitudinal para tirar vantagem do músculo traqueal de enrolar longitudinalmente. Isto permite que imagens de movimento ciliar na vista de perfil ao longo de todo o comprimento traqueal. Vídeos em 200 frames / seg são obtidos usando microscopia de contraste de interferência diferencial e uma câmera digital de alta velocidade para permitir a análise quantitativa da frequência do batimento ciliar e de forma de onda ciliar. Com a adição de partículas fluorescentes durante a imagem, o fluxo de fluido gerado pestanas também podem ser determinados. O tempo de protocolo abrange cerca de 30 min, com 5 min para a preparação de câmara, 5-10 min para a amostramontagem e 10-15 minutos para videomicroscopia.
Introdução
Análise da função cílios móveis no epitélio das vias aéreas é experimentalmente importante para a elucidação dos fatores genéticos e ambientais que podem afetar o transporte mucociliar e saúde pulmonar 1. O protocolo simples desenvolvido para a imagem com o mouse epitélio das vias aéreas fornece um método eficiente para interrogar a motilidade dos cílios das vias aéreas em modelos mutantes e nocaute do mouse e exigem apenas conhecimentos básicos de rato dissecação do tecido traqueal e de imagem ex vivo da motilidade dos cílios das vias aéreas, com alta videomicroscopia resolução. Este protocolo foi criado e aperfeiçoado durante uma tela de mutagên....
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Protocolo
1. Setup reagentes
1.1 Dissection e imagem Médio
L-15, meio de Leibovitz (L15) é suplementado com FBS (10%) e Penicilina-Estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina) é utilizado tanto durante a colheita de amostras de imagens e traqueia.
2. Shallow Walled Assembléia Câmara Cultura
A câmara utilizada para manter o tecido da traqueia é mostrado na Figura 1. O piso da câmara é o vidro ao fundo do poço 35 milímetros prato de cultura. A parte superior e no lado da câmara é gerado pela colocaçã....
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Resultados
Controle cílios das vias aéreas devem ser claramente visíveis e visto a bater de forma coordenada (Filme Suplementar 1; reprodução do filme é retardado até 15% o tempo real), com fluxo perceptível na direção do batimento ciliar (Filme Suplementar 2; reprodução do filme é 100% em tempo real). Quantificação de filmes cílios devem produzir resultados semelhantes ao observado na Figura 3. Recolha de filmes DIC alta velocidade torna possível a quantificação da frequência de .......
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Discussão
Medição da frequência do batimento ciliar (CBF) é relativamente fácil, utilizando objetivos microscópio de alta potência e de hardware de aquisição de imagem rápida 13,15, e explica por que as medições CBF formam a base da maioria dos estudos que investigam a depuração mucociliar durante a saúde ea doença. No entanto, enquanto a CBF medição é essencial para compreender a depuração mucociliar, medição da CBF sozinho ignora a importância fundamental de ambos ciliar fluxo gerado e batimento ciliar forma de onda,.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O projeto foi financiado pelo NIH conceder U01HL098180 do National Heart, Lung, and Blood Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do National Heart, Lung, and Blood Institute e do National Institutes of Health
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Médio | Invitrogen | 21083-027 | Sem vermelho de fenol |
| Soro fetal bovino | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x pinça fina | Roboz | RS-4976 | |
| Tesoura de dissecção | Roboz | RS-5676 | |
| Tesoura de micro dissecação | Roboz | RS-5620 | |
| Bisturi | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 dicas | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm lamínulas de vidro redondas | Fisher Scientific | 430588 | |
| Placas de cultura de plástico de 35 mm | Corning | 430588 | |
| Placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Folha de silicone 0.012" (0.3 mm) de espessura | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μ microesferas de carboxilato de Fluoresbrite YG de diâmetro m | Polysciences | 09834-10 | |
| Microscópio invertido, com objetiva de óleo 100x e filtros DIC | A marca Lecia | DMIRE2 | não é crítica. |
| Lâmpada de mercúrio de 100 watts, filtros de excitação/emissão FITC epifluorescentes | A marca Lecia | não é crítica. | |
| Estágio de microscópio Incubadora | Lecia | 11521749 | Não é necessário se a imagem dos cílios à temperatura ambiente |
| Câmera de alta velocidade campo claro | Vision Research | Phantom v4.2 | A marca não é crítica. Deve ser mais rápido que 125 fps |
| Câmera fluorescente de alta velocidade | Hamamatsu | C9100-12 | A marca não é crítica. Deve ser mais rápido que 10 fps |
| Software de análise de filmes | National Institutes of Health | ImageJ com plug-in |
Referências
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in....
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Reimpressões e permissões
