Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen
Summary
Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.
Abstract
Een ex vivo techniek voor beeldvorming muis luchtwegepitheel voor de kwantitatieve analyse van beweeglijke cilia functie belangrijk inzicht in mucociliaire klaring functie werd vastgesteld. Vers geoogste muis luchtpijp wordt overlangs doorgesneden de trachealis spieren en gemonteerd in een ondiepe ommuurde kamer op een glazen bodem schotel. De trachea monster geplaatst langs zijn lengteas te profiteren van de trachealis spier langsrichting krullen. Dit maakt beeldvorming van ciliaire beweging in het profiel te bekijken langs de gehele tracheale lengte. Video met 200 frames / sec worden verkregen met behulp van differentieel interferentie contrast microscopie en een hoge-snelheid digitale camera aan de kwantitatieve analyse van cilia slagfrequentie en ciliaire golfvorm laten. Met de toevoeging van fluorescerende kralen tijdens beeldvorming, cilia gegenereerd fluïdumstroming ook kan worden bepaald. Het protocol tijd omspant ongeveer 30 minuten, met 5 min voor Kamer voorbereiding, 5-10 minuten voor het monstermontage en 10-15 min bij videomicroscopie.
Introduction
Analyse van beweeglijke cilia functie in het luchtwegepitheel is experimenteel belangrijk voor het ophelderen van de genetische en omgevingsfactoren die mucociliaire klaring en pulmonaire gezondheid 1 beïnvloeden. De eenvoudig protocol ontwikkeld voor de beeldvorming van de muis luchtwegepithelen biedt een efficiënte methode om de luchtwegen trilharen beweeglijkheid ondervragen in mutant en knockout muismodellen en vereisen alleen basisvaardigheden in muis tracheaweefsel dissectie en ex vivo beeldvorming van de luchtwegen trilharen beweeglijkheid met een hoge resolutie videomicroscopie. Dit protocol werd opgesteld en verfijnd tijdens een grootschalige muis mutagenese screen om een snelle evaluatie van de beweeglijke trilharen functie (cilia slagfrequentie, cilia verslaan vorm, cilia gegenereerde stroom) toelaten in mutanten met een aangeboren hartaandoening in verband met heterotaxy 2-5.
Voor deze technieken om luchtwegen cilia beweeglijkheid studie kunnen worden gegroepeerd in hetzij de acute ex vivo aard of longer term in vitro experimentele benaderingen. Acute experimenten zijn ex vivo visualisatie van de menselijke neus / luchtwegen borstel biopten 6,7 en analyse van eenvoudige dwarse luchtwegen secties 8. De in vitro benaderingen gebruiken diverse celkweek technieken om vellen van gedifferentieerde trilharen epitheel, zoals in de lucht-water grensvlak culturen of luchtwegen suspensiekweken 9-11 genereren. Echter, deze luchtwegepitheel reciliation technieken vereisen zeer aanzienlijke investering in tijd en training voordat bruikbare gecilieerde epitheliale cellen worden geproduceerd in experimenten (4-6 weken 9,10). Terwijl acute ex vivo analyse van luchtwegepitheel borstel biopsies worden gewoonlijk gebruikt voor menselijke klinische studies, is deze methode niet bruikbaar muisstudies verergerd door mechanische weefselschade 12.
De techniek die in dit protocol voor de analyse van mouse tracheale luchtwegepitheel is niet alleen eenvoudig te voeren, maar vereist geen speciale vaardigheden of dissectie gespecialiseerde inrichtingen naast die standaard beeldvormend videomicroscopie. Er zijn veel voordelen aan deze eenvoudig protocol. Ten eerste, omdat de muis trachea weefsel oogsten is snel en eenvoudig uit te voeren, is het mogelijk een snelle vaststelling van de luchtwegen cilia functie in een groot aantal muizen. Dit zijn acute analyse van de korte termijn effecten van verschillende in vitro behandelingen. Ten tweede wordt een ex vivo techniek de trilharen luchtwegepitheel bevestigd blijft aan het onderliggende steunweefsel en daarmee geassocieerde signaaltransductie wegen behouden. Daarom in vergelijking met in vitro reciliated luchtwegepitheel, dit preparaat is een betere weergave van de natuurlijke in vivo weefselmilieu. Ten derde, dit protocol kan de verwerving van een aantal verschillende kwantitatieve parameters die de objectieve beoordeling van beweeglijke cilia f kan biedenzalving. Tenslotte, in tegenstelling tot andere methoden voor de luchtwegen trilharen visualisatie Dit protocol maakt visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor profiel te bekijken van de cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia beat en metachronalgolven golfopwekking .
Dit protocol kan worden gemodificeerd op een aantal manieren om een groot aantal experimentele behoeften zoals de rol van farmacologische middelen, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals mucus belast luchtwegen trilharen functie en productie / onderhoud pakken luchtwegen trilharen beat en metachronalgolven golfvoortplanting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meting van cilia slagfrequentie (CBF) is relatief eenvoudig met behulp van hoge microscoop doelstellingen vermogen en snelle image acquisitie hardware 13,15, en legt uit waarom CBF metingen vormen de basis van de meeste onderzoeken naar mucociliaire klaring tijdens gezondheid en ziekte. Hoewel CBF ook essentieel voor het begrijpen van mucociliaire klaring, meting van CBF alleen voorbij de onderliggende belang van beide ciliaire gegenereerde stroom en cilia slaan golfvorm, die beide zijn moeilijker te meten, w…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd ondersteund door NIH-subsidie U01HL098180 van de National Heart, Lung, and Blood Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Heart, Lung, and Blood Institute of de National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
Referências
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
