Homolog rekombinasyon Oluşumlar Recombineering<em> Drosophila</em
Summary
Homolog rekombinasyon teknikleri büyük ölçüde ilerletmek<em> Drosophila</em> Moleküler kesin mutasyon oluşturulması sağlayarak genetik. Recombineering kabul edilen son bir DNA büyük parça işlemek ve onları dönüştürmek sağlar<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Yöntemleri, hızla büyük bir homolog rekombinasyon vektörleri oluşturmak için bu teknikleri birleştirmek Burada yer.
Abstract
Endojen gen loci hızlı, büyük ölçekli manipülasyon teknikleri sürekli gelişimi insan hastalığı ile ilgili araştırmalar için bir genetik model organizma olarak Drosophila melanogaster kullanımını genişletecek. Son yıllarda homolog rekombinasyon ve Recombineering gibi teknik gelişmeler gördük. Ancak, kesin boş mutasyonlar veya etiketleme endojen proteinleri üreten genlerin çoğu için önemli bir çaba olmaya devam etmektedir. Burada, in vivo olarak endojen loci hedef ve işlemek için kullanılabilir vektörler oluşturmak için Recombineering tabanlı klonlama yöntemleri kullanarak teknikleri tarif ve göstermek Özellikle, üç teknolojileri bir arada kurduk:. (1) BAC transgenesis / Recombineering, ( 2) biter-out homolog rekombinasyon ve (3) Ağ Geçidi teknolojisi endojen genomik lokus işlemek için sağlam, verimli ve esnek bir yöntem sağlamaktır. Bu protokol, nasıl (1) tasarım individua hakkında adım adım ayrıntılarıl vektörleri, (2) boşluk tamir, ve (3) nasıl Recombineering bir ikinci tur kullanarak bu vektörlerin içinde ilgi genleri değiştirmek veya etiketlemek için kullanarak homolog rekombinasyon vektörü genomik DNA büyük parçaları klonlamak için nasıl. Son olarak, biz de bir nakavt, veya knock-in üzeri etiketli gen oluşturmak için in vivo olarak bu kasetleri harekete geçirmek için nasıl bir protokol sağlayacaktır. Bu yöntemler kolayca paralel olarak birden çok hedef için kabul edilen ve zamanında ve verimli bir şekilde Drosophila genom işlemek için bir araç sağlamak olabilir.
Introduction
Kendi endojen bölgelerinin tek genlerin moleküler tanımlı manipülasyonlar temizlemek ökaryot biyoloji ile ilgili soru sayısız incelemek için paha biçilmez bir araç sunuyor. Drosophila kaybı fonksiyon-allel üretmek için genetik teknikleri ters Golic ve arkadaşları tanıtıldı kadar zorlu olduğu kanıtlanmış oldu İn vivo gen Drosophila 1-3 ile homolog rekombinasyon kullanılarak hedefleme. Bu, belirli bir genomik lokus entegre bir yapı transgenik DNA doğrusal bir fragmanı kullanılarak hedef olabilir gösterdi. Bu doğrusal "donör DNA" meganuclease I-SCEI ile doğrusal takip FRT-aracılı rekombinasyon (tüketim için dairesel bir molekül olarak kromozom DNA) ile in vivo olarak oluşturulur. Bu yöntem başarılı bir şekilde tanımlanan lezyonların çeşitli oluşturmak için kullanılmış olsa da, bu teknik paralel çok sayıda gen manipülasyonu için kolayca ölçeklenebilir olmamıştır, çünkü her vermemekÇift eleme yapı farklı ve özel tasarım gerektirir. Örneğin, sorunsuz bir şekilde klasik bir kısıtlama enzimi / ligasyon klonlama veya PCR, hem de in vivo transformasyon vektörleri de geleneksel boyut sınırlamaları kullanılarak in vitro olarak DNA (> 5 kb) arasında büyük parçaları manipüle güçlükler çoğu hedefleme homolog rekombinasyon hızla oluşmasına müdahale vektörler. Bu sınırlamaları aşmak için, uçları aşımı geni etkin ve nispeten hızlı bir platform kurmak için metodoloji hedef ile, DNA'nın 100 kb kadar alt klonlama ve transgenesis sağlar Recombineering / transgenesis P [ACMAN] sistemi, kombine Drosophila gen hedef kolaylaştırır.
Rekombinasyon aracılı genetik mühendisliği (Recombineering) 4,5 güçlü bir homolog rekombinasyon bazlı klonlama teknolojidir. Geleneksel sınırlama enzim / ligaz klonlama aksine, Recombineering sırası veya siz ile sınırlı değildirmanipüle DNA e. Recombineering özel E. kullanır kusurlu bir λ profajının 4 tarafından sağlanan rekombinasyon makine barındırır coli. Bu teknik son zamanlarda Drosophila 6,7 kullanılmak üzere kabul edilmiştir. Drosophila Recombineering P [ACMAN] 6,7 adlı değiştirilmiş bir şartlı çoğaltılabilir bakteriyel yapay kromozom (BAC) vektör dayanır. OriV, sekanslama ve embriyo enjeksiyon ve bazal koşullar altında, düşük kopya sayısı, tutar ORIS için gerekli DNA büyük miktarlarda saflaştırılması için kimyasal indüksiyon üzerine yüksek kopya sayısında üretir: Bu vektör, replikasyon kökeni iki taşır. Ayrıca, P [ACMAN] Vektör bakteriyel bir eki (attB) sitesi ile donatılmıştır. AttB Alanı Drosophila 8,9 genomu içinde önceden tespit edilmiş bir iniş yeri içine büyük DNA parçalarının birleşme sağlar ΦC31 integraz aracılı transgenezis için bir alt-tabaka olarak hizmet vermektedir.
Bu sona Çıkış homolog rekombinasyon 10,11 için bir hedefleme vektörü olarak kullanılabilecek bir p [ACMAN] vektörü (p [ACMAN]-KO, 1.0 olarak anılacaktır) üretmiştir. Sisteme hedefleme teknolojisi dahil biter-out gen, iki ÖN ve iki I-SCEI siteleri ekledi. Ayrıca P [ACMAN]-KO 1.0 içine homoloji silah içeren süreci kolaylaştırmak için bu modifiye vektör içinde bir ağ geçidi kaset dahil ettik. Bu hedef vektör içine ilgi hemen hemen her genomik bölge tanıtmak için hızlı ve kolay bir yol sağlar. Bu protokolde P [ACMAN]-KO 1.0, ve nasıl endojen odağı hedef in vivo olarak bu vektör harekete geçirmek için kullanarak bir hedef vektör mühendisi nasıl anlatacağız. Bu protokolün amaçla, ilgili genin yerine RFP / Kan kaseti kullanır, ancak bir antibiyotik seçim işaretleyici içeren kasetlerinin çeşitli Bu protokol kullanılabilir. Bu kaset, bir dizi için tasarlanmış ve başarılı bir şekilde kullanılmışgen değiştirme ve etiketleme 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyomedikal araştırmalarda genetik model organizmaların gücü büyük ölçüde genetik manipülasyon için mevcut araçları dayanmaktadır. Küçük modelleri C. Özellikle elegans ve Drosophila çok hücreli geliştirme veya fonksiyon rol tam yollar ve gen ailelerin ucuz ve hızlı moleküler genetik analizler için izin verir. Son yıllarda Drosophila 14,15 genlerin işlemek için araç gelişiminde önemli gelişmeler gördük. Örneğin yaygın olarak kullanılan …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Hugo Bellen ve reaktifler için Bloomington Stok Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yararlı tartışmalar için Koen Venken, Hugo Bellen ve Buszczak ve Hiesinger laboratuarları tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma ACR için Ulusal Sağlık Enstitüsü (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) hibe tarafından ve MB (RO1GM086647), MB ve PRH (RP100516) için Texas Kanser Önleme Araştırma Enstitüsü tarafından hibe ve Welch için desteklenmiştir PRH için Vakfı (I-1657). MB Biyomedikal Araştırma ve PRH bir EE ve Greer Garson Fogelson Akademik olan UT Güneybatı Tıp Merkezi Biyomedikal Araştırma bir Eugene McDermott Akademik olduğunu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
Referências
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genética. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
