Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Resumo

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes, C. elegans Faz um organismo modelo ideal para In vivo Imagem neuronal relativamente simples, usando técnicas de baixo custo. Aqui descrevemos imagem único neurônio dentro de animais adultos intactos usando codificados geneticamente indicadores de cálcio fluorescentes.

Resumo

O verme nemátodo C. elegans é um organismo modelo ideal para imagens relativamente simples, de baixo custo neuronal in vivo. O corpo transparente e simples pequeno, bem caracterizado, sistema nervoso permite a identificação e imagens de fluorescência de qualquer neurónio dentro do animal intacto. Técnicas de imobilização simples, com um impacto mínimo sobre a fisiologia do animal permitir imagens com lapso de tempo prolongado. O desenvolvimento de fluoróforos geneticamente codificados de cálcio sensíveis como cameleon ¹ e ² permitem GCaMP imagem in vivo de cálcio neuronal relacionada a fisiologia celular e da atividade neuronal. Foram identificadas numerosas estirpes transgénicas que expressam estas fluoróforos em neurónios específicos estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos usando técnicas bem estabelecidas. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para medir a dinâmica do cálcio dentro de um único neurônio in vivo utilizando tanto GCaMP e cameleon. Discutimos vantagens e disadvantidades de ambos, assim como vários métodos de preparação da amostra (imobilização de animais) e análise de imagem. Por fim, apresentamos os resultados de dois experimentos: 1) utilizando GCaMP para medir a resposta sensorial de um neurônio específico para um campo elétrico externo e 2) Usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio de um neurônio a danos de laser traumático. Técnicas de cálcio de imagem, como estes são usados ​​extensivamente em C. elegans e foram estendidos para medições em animais livremente móveis, neurônios múltiplas simultaneamente e comparação entre fundos genéticos. C. elegans apresenta um sistema robusto e flexível para a imagiologia neuronal in vivo com vantagens sobre outros sistemas de modelos em simplicidade técnica e custos.

Introdução

Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados s....

Protocolo

1. Configuração óptica

1. Use um microscópio composto padrão com recursos de imagens de epifluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido com um iluminador HG Intensilight.
2. Para uma melhor imagem e qualidade de sinal usar uma grande ampliação, o objetivo alta abertura numérica. Normalmente usamos uma Nikon X60 1,4 NA objetiva de imersão em óleo. Em alguns casos, é possível a utilização de mais baixa ampliação (X40, X20), dependendo do nível de expressão do fluoróforo e intensidade do sinal.
3. Use uma alta sensibilidade arrefecida CCD da câmara, tal como uma câmera Clara Andor para maximizar a sensibilidade da imagem e ....

Resultados

Aqui apresentamos os resultados de dois experimentos distintos. O primeiro utiliza GCaMP para medir a resposta de um neurónio sensorial específica a um estímulo externo definido, que dá um bom exemplo de como repórteres fluorescentes de cálcio pode ser utilizado para monitorizar a actividade neuronal opticamente em C. intacto elegans. O segundo emprega cameleon para medir a concentração de cálcio intracelular transiente provocado dentro de um neurónio, em resposta ao dano do laser específico, ilustrand.......

Discussão

Indicadores de cálcio geneticamente codificados têm sido amplamente utilizados em C. elegans neurobiologia. Numerosos grupos têm utilizado as técnicas para estudar a resposta de neurónios sensoriais primários a estímulos externos, como aqui demonstrado com a resposta ASJ a um campo eléctrico. Exemplos proeminentes incluem sensação de toque mecânico, produtos químicos específicos, temperatura e um campo elétrico ^{12, 16-19.} Actividade de células do músculo interneurônio e também foram monitorizadas tan.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio invertido Eclipse Ti-U	Nikon
Intensilight HG Iluminador	Nikon	C-HGFI	Fonte de luz fluorescente
CFI Plan Apo VC 60X Óleo	Nikon
Mesa óptica ou placa de ensaio de grau óptico 3'X3'	Thor Labs		Se uma mesa óptica não for usada, uma placa de ensaio de grau óptico em uma bancada de laboratório sólida deve ser suficiente.
Câmera Interline Clara	Andor Technology		Câmera CCD de alta sensibilidade
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	Conjunto de filtros GFP para imagens GCaMP
Filtro 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	filtro de excitação para cameleon
Espelho dicróico > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscópio dicróico para imagem cameleon
Espelho dicróico > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	espelho dicróico para cameleon Filtro de imagem
535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP filtro de emissão
480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP filtro de emissão
Lente, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Lente de relé para óptica FRET (3)
Espelho de banda larga prateado	Thor Labs	ME2S-P01	Óptica FRET (2)
Amortecedor
Levamisol	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, nanopartículas de poliestireno de 2,5% by volume, 50 nm de diâmetro	para C. elegans imobilização Cepa
transgênica, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Cepa PS6388
Cepa transgênica, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Cepa CG1B

NGM