In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans
Summary
Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und Reagenzien<em> C. elegans</em> Ist ein idealer Modellorganismus für<em> In vivo</em> Neuronalen Bildgebung mit relativ einfachen, kostengünstigen Verfahren. Hier beschreiben wir einzelnes Neuron Bildgebung in intakten erwachsenen Tieren mit genetisch kodierten fluoreszierenden Kalzium-Indikatoren.
Abstract
Der Fadenwurm C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für relativ einfache, kostengünstige neuronalen Bildgebung in vivo. Seine kleinen transparenten Körper und einfache, ermöglicht gut charakterisierten Nervensystems Identifikation und Fluoreszenz-Imaging von jedem Neuron im intakten Tier. Einfache Immobilisierungstechniken mit minimalen Auswirkungen auf die Tier-Physiologie ermöglichen erweiterte Zeitraffer-Aufnahmen. Die Entwicklung von genetisch-kodierten Kalzium Fluorophore wie cameleon 1 und GCaMP 2 ermöglichen in-vivo-Bildgebung neuronaler Calcium Zusammenhang sowohl Zellphysiologie und neuronaler Aktivität. Zahlreiche transgenen Stämme exprimieren diese Fluorophore in spezifischen Neuronen sind leicht erhältlich oder können unter Verwendung gut etablierter Techniken hergestellt werden. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Messung Kalzium Dynamik innerhalb eines einzelnen Neurons in vivo sowohl mit GCaMP und cameleon. Wir diskutieren Vor-und disadvantAlter beider sowie verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung (tierische Immobilisierung) und Bildanalyse. Schließlich stellen wir die Ergebnisse von zwei Experimenten: 1) Verwenden GCaMP die sensorische Reaktion eines bestimmten Neurons mit einer externen elektrischen Feldes und 2) Verwenden cameleon die physiologische Calciumreaktion eines Neurons auf traumatische Laserschaden zu messen. Calcium bildgebenden Verfahren wie diese werden ausführlich in C eingesetzt elegans und sind Messungen in sich frei bewegenden Tieren, mehrere Neuronen gleichzeitig und Vergleich erstreckte sich über genetischen Hintergründen. C. elegans stellt eine robuste und flexible Anlage zur in vivo Bildgebung mit neuronalen Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in technische Einfachheit und Wirtschaftlichkeit.
Introduction
Hier präsentieren wir Ihnen praktische Methoden zur in vivo Calcium Imaging in C. elegans Neuronen. Die Entwicklung von genetisch kodierte Calcium-sensitiven Fluorophore mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis macht C. elegans eine vergleichsweise einfache und kostengünstige System zur Messung von neurophysiologischen und Aktivität. Unsere Bildgebung ist mit einem Standardsubstanzsampler Mikroskop unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenzabbildung allgemein verfügbarer Fluorophore getan. Wir präsentieren verschiedene Techniken unter Verwendung verschiedener Fluorophore und verschiedenen Probenvorbereitung, diskutieren die Stärken und Schwächen der einzelnen. Daten werden dann aus zwei Experimenten Beispiel vorgestellt. Eine ausgezeichnete zusätzliche Ressource auf den hier beschriebenen Techniken können in WormBook, "Imaging die Aktivität der Nervenzellen und Muskeln" von R. Kerr, (gefunden werden http://www.wormbook.org ) 3.
Zwei Hauptklassen von gentechnischtisch kodierte fluoreszierende Kalzium-Reporter sind häufig in C eingesetzt elegans: Einkanal GCaMP und FRET-basierten cameleon. Wir beschreiben Methoden und zeigen Beispiele für Daten, die von jedem erzeugt.
GCaMP basiert auf einer modifizierten Green Fluorescent Protein (GFP), die empfindlich auf die umgebende Calciumkonzentration basiert. Dies wird durch Fusion von GFP und dem hohen Calcium-Calmodulin Protein Affinität, so dass die Bindung von Calcium durch Calmodulin das GFP-Molekül bringt in einen effizienten fluoreszierenden Bestätigung 2 bewerkstelligt. Die jüngsten Fortschritte in dieser Fluorophore erzeugen außergewöhnlich gutes Signal Größe mit bis zu 500% Anstieg der Fluoreszenzintensität über einen physiologischen Bereich von Kalzium und einigermaßen schnell Kinetik ~ 95 ms Anstiegszeit und ~ 650 ms Abklingzeit 4. Über relativ kurze Zeiträume (Minuten), können diese großen Signale für niedrigere Auflösung Bildgebung ermöglichen (untere Vergrößerung) und bei einem wohlerzogenen initial Baseline-Messung, negieren die Notwendigkeit ständiger Grundlinie oder Vergleichsmessungen.
Cameleon hat den Vorteil, eine FRET-Fluorophor, das eine Quotientenmeßschaltung Vergleichens zwei unabhängige Kanäle oder Wellenlängen 1 erzeugt. Es besteht aus zwei separaten Fluorophore (Cyan-und Gelb-emittierende fluoreszierende Proteine, CFP und YFP) durch eine Calmodulin Protein verknüpft ist. Der Komplex wird mit blauem Licht (440 nm), die die GFP regt beleuchtet. Bindung von Calcium bringt die Fluorophore näher zusammen, wodurch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von dem GFP (Donor) zum YFP (Akzeptor) und Veranlassen des GFP-Emission (480 nm) zu verringern und das YFP-Emission (535 nm) bis zu erhöhen . Relative Kalziumspiegel werden als das Verhältnis des YFP / GFP Intensität gemessen. Cameleon Kinetik langsamer als die GCaMP, in vivo gemessen werden, um eine Anstiegszeit von ~ 1 sec und eine Abfallzeit von ~ 3 sec 5 haben. Jedochdas Verhältnis der gegenläufigen Signale erhöht die Signalgröße und kompensiert einer Anzahl möglicher Artefakte aufgrund veränderter Fluorophorkonzentration, Bewegung oder Fokusdrift und Bleichen.
Genetisch codierte fluoreszierende Reporter zu negieren viel von der Probenvorbereitung mit exogen verabreichtem Sonden und C geforderten elegans kleinen transparenten Körper ermöglicht die Abbildung innerhalb des intakten Tier mit einfachen weites Feld Fluoreszenz. Die wichtigste technische Herausforderung in der Probenvorbereitung ist daher sicher fixieren die Tiere. Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen häufigsten verwendeten Techniken mit jeweils Vorteile und Nachteile. Verwendung eines pharmakologischen Agens, um die Tiere zu lähmen ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Montage mehrerer Tiere an einer Zubereitung (Levamisol, ein cholinerger Agonist, Muskelgewebe führt zu ergreifen ist typischerweise 6 verwendet). C. elegans kann auch physisch durch die Montage ihnen immobilisiert werdenauf steifen 10% igen 7, 8. Dies minimiert Auswirkungen auf die Physiologie von Tieren, ermöglicht langfristige Bildgebung (Stunden) und Rückgewinnung von mehreren Tieren ist aber technisch schwierig. Beide Techniken den physischen Zugriff auf die Tiere (die unter einem Deckglas) und kann daher nur mit bestimmten experimentellen Stimuli (wie Licht, Temperatur, elektrisches Feld oder Laser-Schaden) verwendet werden. Für Impulse in der physischer Zugriff erforderlich ist, wie Touch-oder die Verabreichung von Chemikalien, haben viele Studien erfolgreich C. geklebt elegans in Ort (mit Veterinär-Grade-Kleber) 9. Dies ist technisch anspruchsvoller, ist nur ein einziges Tier Vorbereitung und erlaubt keine tierischen Erholung. Schließlich haben zahlreiche mikrofluidischen Bauteilen eingesetzt, dass körperlich zurückzuhalten C. elegans, kann die Erhaltung Tierphysiologie, so dass die Exposition gegenüber den meisten Arten von Stimuli (je nach Geräteausführung) und ermöglichen einen schnellen Austausch und Erholung der Tiere <sup> 10, 11. Allerdings Mikrofluidik erfordern zusätzliche technische Kenntnisse und Fähigkeiten in Design, Herstellung und Implementierung. In immobilisierten Tieren Aktivität und Stimulus-Antwort kann in der Regel in den sensorischen und Interneuronen gemessen werden. Aktivität von Motoneuronen erfordert ausgefeiltere Techniken zur Bildgebung in bewegenden Tieren. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden unter Verwendung der beiden am einfachsten Techniken der pharmakologischen Lähmung und Immobilisierung mit steifen Agarose.
Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um neuronale Aktivität und Zellphysiologie in C messen elegans. Wir geben jeweils ein Beispiel: Verwendung GCaMP die sensorische Reaktion des ASJ Neuron zu einem äußeren elektrischen Feld zu messen, und Verwenden cameleon die physiologische Reaktion auf Calcium Laserschaden eines Neurons zu messen. Diese Beispiele zeigen die Vorteile und Nachteile der beiden Arten von Fluorophoren und zeigen, was möglich ist mit dem System.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wurden weitgehend in C genutzt elegans Neurobiologie. Zahlreiche Gruppen haben diese Techniken verwendet werden, um Reaktion der primären sensorischen Neuronen auf äußere Reize zu studieren, wie hier mit dem ASJ Reaktion auf ein elektrisches Feld demonstriert. Prominente Beispiele umfassen Empfindung mechanische Berührung, bestimmte Chemikalien, die Temperatur und ein elektrisches Feld 12, 16-19. Aktivität von Interneuronen und Muskelzellen haben a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mehrere Personen trugen zu der Arbeit in diesem Papier beschrieben. CVG baute den Versuchsaufbau und LS, SHC und CVG führten die Experimente. CVG und SHC schrieb das Manuskript. Alle Autoren anschließend nahmen an der Überarbeitung und genehmigt die endgültige Kopie des Manuskripts. Wir danken Paul Sternberg für die GCaMP Belastung. Einige Nematoden Stämme in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC), die durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Die MATLAB Bildanalyse-Programm wurde von dem in 18 abgestimmt sind. Die Autoren wurden von der Boston University und dem Massachusetts Life Sciences Center unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
Referências
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