רומן<em> Ex vivo</em> שיטת תרבות ללב העכבר העוברית
Summary
מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.
Abstract
מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. לפיכך, פרוטוקולים לבודד ואיברים בודדים התרבות של עניין חיוניים כדי לספק שיטה של שתי אסטרטגיות הטיפול החדשניות לדמיין שינויים בפיתוח ומאפשרים. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל. מצע זה מספק מספיק תמיכה כדי לשמור על המבנה תלת ממדים, אבל הוא גמיש מספיק כדי לאפשר המשך התכווצות. בקיצור, לבבות הם נכרת מן העובר והניחו בתערובת של Matrigel הקר דילול 01:01 עם מדיום גידול. לאחר Matrigel המדולל מתמצק, מדיום גידול מתווסף למנת התרבות. לבבות עקורים מאוחר ככל יום עוברי 16.5 היו מעשיים עבור ארבעה ימים שלאחר נתיחה. ניתוח של מקלעת כלילית מראה כי שיטה זו אינהלשבש את התפתחות כלי דם כלילית. לפיכך, אנו מציגים שיטה חדשנית לתרבות לטווח הארוך של לב עוברי.
Introduction
בשנים האחרונות, העכבר המהונדס כבר את מערכת המודל העיקרית לחקר התפתחות מומי לב. עם זאת, אורגניזמים מודל אחרים, כגון דג הזברה, שהוכחו יש יתרונות משמעותיים על פני העכבר. שלושה יתרונות עיקריים של דג הזברה הם הנחת החיצונית של ביצים, על מנת להקל על גישה לעוברים; שקיפות האופטית של העוברים, מה שמאפשרת הדמיה קלה של התפתחות לב, ואת הקלות של יישום טיפולים מולקולריים קטנים כדי לווסת את התפתחותו של העובר 1. לפיכך, הפיתוח של טכניקת התרבות שאפשרה צמיחת רחם לשעבר של איבר עוברי הייתי לעקוף, לפחות בחלקו, את המגבלות כיום חוו על ידי חוקרים לומדים תהליכי התפתחות בעכברים מהונדסים.
מערכות תרבות לב לשעבר vivo פותחו בשניהם חומוס ועובר עכבר המאפשרים טיפול עם מולקולות קטנות וניתוח של איך אונטערשיידאזורים שונים שממפים של לב תקשורת 2-6. לכל עכבר תרבות לב, לב שנלקח מעוברים עד עוברי (E) יכול להיות ממוקמים בגיל 12.5 במדיום התרבות עם או בלי נדנדה 2,3,5. באמצעות טכניקה זו, לב עוברי טופח בהצלחה לשקילות של E13.5, ולב בתרבית עם נדנדה נשמר כל עוד שלושה ימים (החל משעת E10.5) 3. עם זאת, מחקרים לא דיווחו התרבות המוצלחת של לב מעוברים מבוגרים יותר. כמו כן, ניסויי הצלה היו מוגבלים להחלת הסוכן הטיפולי ברחבי העולם לתרבות בינונית 2.
מערכת התרבות פרוסה, שבלבם הם נכרת, מוטבעים, ומחולק באמצעות vibratome, גם נוצלה לשני לבבות צעירים יותר, כגון E12.5 לבבות עכבר חומוס ולבבות בשלב 36 (כ E16 בעכבר) המבורגר-המילטון 2,4,6, ומעלה את לב, כמו שלאחר לידה ומבוגרים עכבר שעותearts ולבבות אדם מבוגר 7,8. בעוד שהניתוחים העובריים מנוצלים בדרך כלל סעיפי 2,4-150 מיקרומטר עבים, עובי סעיף יכול להיות גדול כמו 500 מיקרומטר ללא עדות למחסור בחמצן 8. תרבויות פרוסה אלה קוימו כל עוד חודשים בתרבות, עם רוב פרוסות שמירת contractility לאורך תקופה זו 9. בהשוואה למחקרים בcardiomyocytes מבודד, תרבויות פרוסה אלה מאפשרים שיתוף התרבות של cardiomyocytes עם סוגי התאים השכנים שלהם ולספק שיטה יעילה לניתוח vivo לשעבר. עם זאת, תרבויות אלה דורשים משוכללים יותר ההגדרה מאשר פשוט הצבת לב במדיום התרבות (למשל הטבעת הלב החי עבור חתך בvibratome), וכל ניתוח הוא כמובן מוגבל לחלק של הלב בתוך הקטע.
בהתחשב במגבלות שתוארו לעיל ללב עכבר עוברי culturing והשפע של עכברים מהונדס אווהilable למחקר, פיתחנו מערכת לשעבר vivo עכבר לב התרבות דומה למערכת תרבות ריאות vivo לשעבר שפותחה על ידי ויבר, מערכת et al. 10 התרבות מאפשרת תרבות לטווח ארוך והדמיה של זרימת הדם הכליליים שיפוץ בתוך כל לב עכבר עוברי. בנוסף, השימוש בMatrigel מאפשר חרוזים שיתקיימו במקום סמוך ללב, ובכך לספק טיפול מקומי עם סוכנים טיפוליים. ניתן לבצע ניסויים אלה בנקודות זמן התפתחות שונות כדי להשוות את ההשפעה של טיפול שניתן בתהליך כגון היווצרות עורקים כלילית. בגלל מולקולות קטנות יכולות לנטרל באמצעות Matrigel, מערכת זו התרבות יכולה לשמש גם לאזורי התרבות גזורים של הלב אחד ליד שני כדי לקבוע אם אנשי קשר ספציפיים תאי תאים נחוצים לתהליכים התפתחותיים מסוימים או אם איתות paracrine מאזור אחד למשנהו צורך בכך.
מערכת זו התרבותהוא פשוט יחסית, ובניגוד למערכת התרבות הפרוסה, עושה שימוש בחומרים כימיים תרבות הבסיסיות ולהגדיר קופצים, כי הם זמינים ברוב המעבדות. בקיצור, לב עוברי בתרבית ניכר בMatrigel לדלל, המספק תמיכה מוצקה למחצה. תמיכה זו היא מספיק כדי לשמור את המורפולוגיה תלת ממדית של הלב בעת גם מאפשר ללב חוזה. באמצעות מערכת זו, ניתן לשמור על לב שלם מעוברי עכברים מבוגרים יותר (E14.5-E16.5) בתרבות לתקופה של עד ארבעה ימים. מקלעת כלילית כולו נשמר, שלא כמו בתרבויות פרוסה, כך שכל רמזי איתות המתרחשים באזורים שונים של הלב להישאר בהווה. יתר על כן, צבעי ניאון לחיות תאים יכולים לחלחל Matrigel כדי לאפשר הדמיה של הלב החי, והוא יכול להיות ממוקמים חרוזים חלבון מצומדות ליד הלב כדי לספק מקור איתות מקומי. יחד, יתרונות אלו הופכים טכניקה זו שיטה אידיאלית ללימוד תהליכים התפתחותיים בembryonלב עכבר IC.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת התרבות הנוכחית מהווה יתרונות משמעותיים למחקרי לב עכבר עובריים. מערכת זו התרבות משמרת contractility שריר הלב ומקלעת כלילית, עם סימנים מוגבלים של נמק, גם לאחר ארבעה ימים בתרבות. יתר על כן, המטריצה מוצקה למחצה מספקת מספיק תמיכה כדי לשמור על המורפולוגיה תלת ממדית של הל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד וNIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
Referências
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
