Dit protocol laat twee inoculatie methoden om de schimmel entomopathogen introduceren<em> Beauveria bassiana</em> Als endofyt in de gewone boon (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding.
Beauveria bassiana is een schimmel entomopathogen met de mogelijkheid om endophytically koloniseren planten. Als endofyt, B. bassiana kunnen een rol spelen bij het beschermen van planten herbivorie en ziekte. Dit protocol laat twee infectiemethoden te stellen B. bassiana endophytically in de gewone boon (Phaseolus vulgaris), ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding. Planten worden gekweekt uit het oppervlak gesteriliseerde zaden gedurende twee weken voordat een B. bassiana behandeling van 10 8 conidia / ml (of water) toegepast hetzij als bladspray of een bodem doordrenken. Twee weken later worden de planten geoogst en hun bladeren, stengels en wortels worden bemonsterd om endofytische schimmelkolonisatie te evalueren. Hiervoor worden monsters afzonderlijk oppervlak gesteriliseerd, in meerdere secties gesneden en geïncubeerd in aardappel dextrose agar media gedurende 20 dagen. De media wordt gecontroleerd om de 2-3 dagen tot schimmelgroei te observeren alssamenhingen met installatiedelen en noteer het optreden van B. bassiana de omvang van de kolonisatie endofytische schatten. Analyses van inoculatie succes vergelijken het optreden van B. bassiana binnen een bepaald plantendeel (dat wil zeggen bladeren, stengels of wortels) over behandelingen en controles. Naast de beëntingsmethode de specifieke resultaat van het experiment afhangen van de gewassen soort of variëteit, de schimmel entomopathogen species stam of isolaat gebruikt en de plant groeiomstandigheden.
Schimmel entomopathogens belangrijke regulatoren zijn van insecten populaties met een aanzienlijk potentieel als mycopesticides 1. Pas recent hebben echter schimmel entomopathogens aangetoond dat het plaatsvindt als endofyten, zowel natuurlijk als reactie op verschillende infectiemethoden 2. De ecologische functie van endofytische schimmel entomopathogens blijft grotendeels onbekend, maar sommige studies hebben ze in de groei van planten 3,4, herbivoor weerstand 5-8, en ziekteresistentie 9,10. De algemene doelstelling van de methoden die hier gepresenteerd is een schimmel entomopathogen te introduceren als een endofyt, ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) is de best bestudeerde endofytische schimmel entomopathogen 5-9,11-19, en het is beschikbaar als een commercieel mycopesticide. Infectiemethoden getest om vast te stellen <em> B. bassiana als endofyt zijn bodem doorweekt 14,17, zaadcoatings 18 en onderdompelingen 14, kiemwortel dressings 13,15, wortel en wortelstok onderdompelingen 11,16,18, stengel injecties 17, blad-sprays 14,17,20 en bloemtakken 19. Met behulp van deze methoden, hebben de onderzoekers geïntroduceerd B. bassiana in banaan 11, bonen 7, cacao 13, koffie 17, maïs 7, katoen 7, dadelpalm 12, jute 21, opium poppy 20, pompoen 7, pine 18, sorghum 14, tomaat 7 en tarwe 7. Recente gegevens wijzen erop dat endofytische B. bassiana heeft de potentie om planten te beschermen niet alleen geleedpotigen plagen 5-7,22-27, maar ook van een plantpathogenen 9.
De gewone boon (Phaseolus vulgaris) behoort tot de meest kwetsbare gewassen tegen ziektenen ziekten. Het kan worden beïnvloed door meer dan 400 plagen en 200 pathogenen waarvan aanval wordt beschouwd als de meest beperkende factor boonproductie tussen regio 28 zijn. Bijgevolg kunnen de gewone boon zijn een uitstekend model gewas om het volledige spectrum van endofytische biologische bestrijding te onderzoeken door B. bassiana. Als eerste stap in deze richting, in dit artikel beschreven blad sprays en bodem doorweekt als inoculatie methoden om B.bassiana te introduceren als een endofyt in de gewone boon.
Vele factoren kunnen invloed hebben op de specifieke uitkomst van een experiment om een schimmel entomopathogen als een endofyt vast te stellen. Onze resultaten tonen de beëntingsmethode is er een van. Biologische factoren om te experimenteren met onder meer het gewas of de cultivar geselecteerd en de schimmel entomopathogen soort stam of isoleren gebruikt. Andere factoren om te overwegen het manipuleren van bijvoorbeeld de concentratie van het inoculum, de leeftijd van de plant tijdens de inentingen, en de plant groeiomstandigheden.
Het zou ideaal zijn voor een inenting methode om de systemische planten kolonisatie leiden door een schimmel entomopathogen 14,17,18,21. In plaats daarvan blijkt dat infectiemethoden vaak een bepaald patroon van lokale kolonisatie bevorderen. In koffie, bijvoorbeeld, blad sprays voorstander blad kolonisatie overwegende dat de bodem doorweekt voorstander wortelkolonisatie 17. We vonden hetzelfde patroon in de gewone boon. Uiteindelijk moet de keuze van de inoculatie methodegeleid door de geplande locatie van de endofyt binnen een plant, vermoedelijk overeenkomt met de niche van het doel herbivoor of plant pathogeen.
Hoewel vaak gebruikt, endofyt detectie en kwantificering op basis van media culturen kan kostbaar, moeilijk en gevoelig voor fouten. Zo werden er in totaal 10.800 installatiedelen (uitgeplaat op 1.800 petrischaaltjes) geëvalueerd in een experiment om B. te optimaliseren bassiana inentingen op banaan 16. Van deze werden 4.496 secties gekoloniseerd door een vermeende B. bassiana, zoals geïdentificeerd voornamelijk door kolonie morfologie. Uiteraard zou microscopische controle van de soort per kolonie is een gewenst maar onbetaalbaar stap. Anderzijds werden 1176 delen gekoloniseerd door andere schimmels en werden weggegooid en behandeld als ontbrekende gegevens 16. De kans bestaat echter dat B. bassiana was een arme concurrent of langzamer te groeien, en kan uiteindelijk zijn voortgekomen uit die secties als er eenllowed voldoende tijd. Daarom endofyt detectiemethoden op basis van media-culturen zijn onderworpen aan valse positieven en valse negatieven. Bijgevolg is de ontwikkeling van betrouwbare detectie en kwantificering, bijvoorbeeld die gebaseerd op polymerase chain reaction (PCR) assays 20,21,24 wordt gerechtvaardigd.
Het uiteindelijke doel voor inoculatie-experimenten zou moeten zijn om een efficiënte behandeling die duurzame systemische resistentie biedt tegen herbivorie en / of ziekte te ontwikkelen. Een plausibel, maar nog niet getest, hypothese is dat de mate van endofytische kolonisatie positief moeten correleren met de mate van endofyt-gemedieerde resistentie. Een logische volgende stap na verfijning infectiemethoden dus zou kunnen zijn om deze correlatie te onderzoeken. Verschillende video-protocollen kan onderzoekers helpen een geschikte weerstand test te ontwerpen voor een doel plaag-of ziektedruk 29-31. Uiteindelijk is deze assay wat bepaalt het succes van de inoculathode en de bijbehorende mogelijkheden voor endofytische biologische bestrijding.
The authors have nothing to disclose.
De productie en het experimentele werk die hierin weerspiegelen de toegewijde en enthousiaste hulp van Reynaldo Pareja. Gefinancierd door Bestuursdienst Colombia van Wetenschap, Technologie en Innovatie (Colciencias) en door een subsidie van de Bill & Melinda Gates Foundation door de Grand Challenges Explorations initiatief.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |