تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس
Summary
تفاعلات البروتين العابر للخلايا هي محددات هامة من البنكرياس وظيفة خلايا بيتا. مفصلة هنا هو الأسلوب مقتبس من نموذج coculture من synaptogenesis للتحقيق في كيفية تأثير البروتينات عبر الغشاء محددة إفراز الأنسولين. Transfected HEK293 خلايا التعبير عن البروتينات في المصالح؛ خلايا بيتا لا تحتاج إلى transfected أو خلاف ذلك مضطرب مباشرة.
Abstract
التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيق وظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التفاعلات بين البروتينات عبر الغشاء على أسطح خلايا بيتا المجاورة عوامل هامة في تحديد وظيفة خلايا بيتا.
توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط التحليلات للآثار من التفاعلات المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة وربما منع الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات داخل نفس غشاء الخلية لتكون DIStinguished من آثار التفاعلات العابر للخلايا.
هنا يتم تقديم طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا. هذه الطريقة تنطبق على خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1 خلايا، وفصلها إلى خلايا بيتا الأولية. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا البروتينات التي تم تحديدها مهم للقيادة تشكيل المشبك. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن نضوج وظيفية خلايا بيتا قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة. قمنا بتطوير نظام حيث يتم استزراع خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة. في هذا النموذج، يتم بمنأى السيتوبلازم خلايا بيتا في حين خارج الخلية interactio البروتين البروتينيتم التلاعب نانوثانية. على الرغم من أننا نركز هنا في المقام الأول على دراسات من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، وعمليات أخرى يمكن تحليلها، على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني على النحو الذي يحدده immunoblotting أو QPCR.
Introduction
نحن هنا وصف طريقة لتسهيل التحقيقات في كيفية المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء محددة تؤثر على إفراز الأنسولين. تحقيقات أسلوب آثار تفاعلات البروتين في المصالح مع البروتينات (أو ربما الجزيئات الأخرى) على سطح البنكرياس خلايا بيتا. الأسلوب يسمح التحقيقات لكيفية بروتينات سطح الخلية التي أعربت عنها خلايا بيتا أو بواسطة الخلايا المجاورة الأخرى (مثل الخلايا البطانية، الخلايا العصبية، خلايا ألفا البنكرياس) تؤثر على وظيفة خلايا بيتا من خلال التفاعلات العابر للخلايا (أي من خلال التفاعل مع الشركاء التفاعل على سطح مجاور خلايا بيتا).
الغشاء البلازمي الخلوي يحتوي على مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية والوظيفية التي تخدم كجسر للبيئة خارج الخلية. عن طريق تشكيل اتصالات العابر للخلايا أو عن طريق بدء الأحداث يشير البلاستيك، يمكن أن التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيقوظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز 1. كما كشفت، على سبيل المثال، من أهمية خارج الخلية EphA-ephrinA وneuroligin-2 التفاعلات في تنظيم الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، أصبح من أي وقت مضى أكثر وضوحا أن زيادة معرفة التفاعلات التي تحدث بين البروتينات خارج الخلية على سطوح المجاورة خلايا بيتا ستكون ذات أهمية كبيرة لاكتساب فهم كامل من إفراز الأنسولين، بيتا خلية النضج وظيفية والحفاظ على توازن الجلوكوز 1-3. والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو تمكين التحقيقات من آثار على وظيفة خلايا بيتا من التفاعلات العابر للخلايا التي تنطوي على الغشاء محددة أو البروتينات خلاف ذلك، على سطح الخلية المرتبطة. من قبل خلايا بيتا شارك في زراعة الخلايا مع HEK293 transfected مع بنيات التعبير المختلفة، والآثار على بايتا وظيفة الخلية من مختلف البروتينات على سطح الخلية أو المتغيرات تحور منه يمكن أن يكون بحثها بكفاءة. ويتم إنجاز هذا دون الحاجة إلى بالنقل خلايا بيتا أنفسهم.
توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا خلايا بيتا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط تحليلات آثار التفاعلات خارج الخلية المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة، وعلاوة على ذلك، لا تسمح الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات على أو في نفس الخلية لتمييزها عن آثار التفاعلات العابر للخلايا. هنا، وهي طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا هو أن described. هذه الطريقة تنطبق على إفراز الانسولين خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1-4 خلايا، والقوارض الأولية فصلها أو خلايا بيتا الإنسان. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا يمكن تحديد البروتينات التي تدفع تشكيل المشبك 5،6. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن وظيفة خلايا بيتا والنضج وظيفية قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة 7-9. من أجل تحقيق هذه التفاعلات، قمنا بتطوير نظام الموصوفة هنا التي يتم cocultured خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة 10. هذا النظام يسمح السيتوبلازم خلايا بيتا لتظل بمنأى بينما يتم معالجته خارج الخلية البروتين البروتين التفاعلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة coculture الموصوفة هنا يوفر وسيلة فعالة لتحديد أهمية الفسيولوجية للبروتينات بيتا على سطح الخلية، الغشاء محددة، وعلى وجه التحديد من المجالات الخاصة بهم خارج الخلية. من قبل خلايا بيتا زراعة الخلايا أو ورم جزيري (مثل الخلايا INS-1 يعمل هنا) في اتصال مع خلايا HEK293 عرض بروت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01DK080971 والأحداث مؤسسة أبحاث السكري منحة 37-2009-44. كما أننا نقدر الدعم الذي تلقته من مركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو لطب الاطفال أبحاث السكري (PDRC).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10X PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
