膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析
Summary
経細胞タンパク質相互作用は、膵臓β-細胞機能の重要な決定因子である。法適応特定貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査するためのシナプス-の共培養モデルからは、ここで詳しく説明します。トランスフェクトしたHEK293細胞は、目的のタンパク質を発現し、β細胞は、トランスフェクションまたは他の方法で直接摂動する必要はありません。
Abstract
細胞表面タンパク質間の相互作用は隣接セルの機能を調整するのに役立ちます。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために調整された様式で作用している。これは、隣接したβ細胞表面の膜貫通タンパク質間の相互作用は、β細胞機能の重要な決定要因であることがますます明らかになりつつある。
培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的影響の分析を混乱させることができる方法でβ-細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、mRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする具体的な相互作用の。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、DISであることが同じ細胞膜内のタンパク質間の相互作用による影響を防ぐことが近づく経細胞の相互作用の影響からtinguished。
ここでβ細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法が提示される。この方法は、例えば、INS-1細胞などのベータ細胞株、および解離プライマリβ細胞にも適用可能である。それはシナプス形成を駆動するための重要なタンパク質を同定したHEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質への培養神経細胞のその露出を発見した神経生物学者が開発した共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々はβ細胞機能の成熟は、同様の経細胞の相互作用によって駆動されるかもしれないと考えた。我々は、β細胞は、目的のタンパク質を発現するHEK293細胞層上で培養されたシステムを開発した。このモデルでは、β-細胞の細胞質は、細胞外タンパク質interactioながらそのままですNSは、操作されます。我々は、主にグルコース刺激性インスリン分泌の研究に焦点を当てているが、ここで、他のプロセスを解析することができ、例えば、遺伝子発現の変化は、免疫ブロット法または定量PCRによって決定される。
Introduction
ここでは、特定の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、インスリン分泌をどのように影響するかの調査を容易にする方法が記載されている。膵臓β-細胞表面上のタンパク質（あるいは他の分子）と目的のタンパク質との相互作用の影響方法プローブ。この方法は、ベータ細胞または他の隣接セル（ 例えば、内皮細胞、神経細胞、膵臓α細胞）によって発現細胞表面タンパク質は、細胞間の相互作用（ すなわち、隣接する表面上の相互作用パートナーとの相互作用を介し介しβ細胞機能にどのように影響するかの調査を可能にするβ細胞）。
細胞の形質膜は、細胞外環境へのブリッジとしての構造的および機能的タンパク質の複雑な配列が含まれています。経接続の形成によりまたはプラスチックシグナル伝達事象を開始することにより、細胞表面タンパク質間の相互作用は、コーディネートすることができ隣接セルの機能を有する。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために、1協調して作用している。細胞外EPHA-ephrinAおよびグルコース刺激性インスリン分泌の調節におけるニューロリギン-2相互作用の重要性によって、例えば、明らかにし、それがますます明らかになってきている隣接表面にタンパク質との間に発生する相互作用の増大した細胞外知識ベータ細胞がインスリン分泌、β細胞機能の成熟と1-3グルコース恒常性の維持の完全な理解を得るための非常に重要になります。ここに記載された方法の目的は、特定の膜貫通または他の細胞表面結合タンパク質を含む経細胞相互作用のβ細胞機能への影響の調査を可能にすることである。異なる発現構築物でトランスフェクトしたHEK293細胞との共培養β細胞、Bの効果によって異なる細胞表面タンパク質または変異した変異体のイータ細胞機能としては、効率的に探査することができる。これは、β細胞自体をトランスフェクトすることなく達成される。
培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的の分析を混乱させることができる方法でβ細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、β-細胞のmRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする特定の細胞外相互作用の効果。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、さらに、経細胞間相互作用の影響を区別する上で、同じ細胞内のタンパク質間の相互作用による影響を許可しない近づく。ここでは、β細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法は、descrをあるアイベッド。この方法は、例えば、INS-1細胞4とインスリン分泌β-細胞株、および解離プライマリげっ歯類またはヒトβ細胞にも適用可能である。なお、HEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質に培養ニューロンの露出がドライブシナプス形成5,6というタンパク質を同定することができるが見つかりました神経生物学者、によって開発された共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々は、β細胞機能を推論し、機能的成熟は、同様の経細胞の相互作用7-9によって駆動されることがあります。これらの相互作用を調査するために、我々は、β細胞が関心10のタンパク質を発現するHEK293細胞の層上に共培養された本明細書に記載のシステムを開発した。このシステムは、細胞外タンパク質 – タンパク質相互作用を操作しながらベータ細胞質をそのまま維持することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
共培養方法は、β-細胞表面の特異的膜貫通タンパク質の、特にその細胞外ドメインの生理学的重要性を決定するために効果的な方法を提供ここで説明する。細胞表面上の関心のあるタンパク質を表示するHEK293細胞と接触で培養β細胞又はインスリノーマ細胞（例えば、ここで用いINS-1細胞など）により、実験を直接妨げることなく、細胞外タンパク質 – タンパク質相互作用の効果を決定するよ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康助成R01DK080971と若年性糖尿病研究財団助成37-2009-44の国立研究所によってサポートされていました。また、UCSD小児糖尿病研究センター（PDRC）から受け取った支援に感謝。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10X PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
