Coculture Analyse av Ekstracellulære protein interaksjoner som påvirker insulinsekresjon ved betaceller i bukspyttkjertelen

Summary

Transcellular protein interaksjoner er viktige determinanter av pankreatisk p-celle-funksjon. Detaljert her er en metode tilpasset fra en coculture modell av synaptogenesis-for å undersøke hvordan spesifikke transmembrane proteiner påvirker insulin sekresjon. Transfekterte HEK293-celler uttrykker proteiner av interesse; beta celler trenger ikke å bli transfektert eller på annen måte direkte perturbert.

Abstract

Interaksjoner mellom celle-overflateproteiner å koordinere funksjon av nabocellene. Betaceller i bukspyttkjertelen er gruppert sammen i bukspyttkjertelen holmer og handle på en koordinert måte for å opprettholde glukose homeostase. Det blir stadig mer klart at samspillet mellom transmembrane proteiner på overflaten av tilstøtende betacellene er viktige faktorer som bestemmer beta-celle funksjon.

Klarlegging av rollene til bestemte transcellular interaksjon ved knockdown, knockout eller overexpression studier i dyrkede betacellene eller in vivo nødvendiggjør direkte forstyrrelse av mRNA og protein uttrykk, potensielt påvirker beta-celle helse og / eller funksjon på måter som kan forvirrer analyser av effektene av spesifikke interaksjoner. Disse tilnærminger også endre nivåene av de intracellulære domenene til de målrettede proteiner og kan hindre effekter på grunn av interaksjonen mellom proteinene i samme celle membran for å bli fortrengtskredtatte fra virkningene av transcellular interaksjoner.

Her er en fremgangsmåte for å bestemme virkningen av bestemte transcellular interaksjoner på insulin-utskillende kapasitet og responsen til beta-celler er presentert. Metoden kan anvendes til beta-cellelinjer, slik som INS-1 celler, og til dissosiert primære betaceller. Den er basert på coculture modeller utviklet av neurobiologists, som fant at eksponering av dyrkede nerveceller til spesifikke nevrale proteiner uttrykt på HEK293 (eller COS) cellelagene identifiserte proteiner viktige for kjøring synapse formasjon. Gitt parallellene mellom sekretoriske maskiner av nevrale synapser og av beta-cellene, resonnerte vi at beta-celle funksjonelle modning kan være drevet av lignende transcellular interaksjoner. Vi har utviklet et system hvor beta-celler dyrket på et sjikt av HEK293-celler som uttrykker et protein av interesse. I denne modellen er den beta-cellen cytoplasma urørt mens ekstracellulært protein-protein interactions er manipulert. Selv om vi her primært fokuserer på studier av glukose-stimulerte insulin sekresjon, kan andre prosesser som skal analyseres, for eksempel endringer i genekspresjon som bestemt ved immunoblotting eller qPCR.

Introduction

Vi beskriver her en metode for å legge til rette for undersøkelser av hvordan de ekstracellulære domener av spesifikke transmembrane proteiner påvirker insulin sekresjon. Fremgangsmåten omfatter påføring på prober virkningene av interaksjoner av proteinet av interesse med proteiner (eller eventuelle andre molekyler) på pankreatisk p-celle-overflate. Fremgangsmåten tillater undersøkelser av hvordan celle-overflateproteiner uttrykt av betaceller eller av andre nabocellene (f.eks endoteliale celler, nerveceller, pankreatiske alfa-celler) påvirker betacellefunksjonen gjennom transcellular interaksjoner (dvs. gjennom interaksjoner med interaksjonspartnere på overflaten av tilstøtende betacellene).

Den cellulære plasma membran inneholder en kompleks rekke strukturelle og funksjonelle proteiner som fungerer som broer til den ekstracellulære miljøet. Ved dannelsen av transcellular forbindelser eller ved oppstart av plast signalering hendelser, kan interaksjoner mellom celle-overflate proteiner hjelpe koordinerefunksjon av nabocellene. Betaceller i bukspyttkjertelen er gruppert sammen innenfor bukspyttkjertelen holmer og handle på en koordinert måte for å opprettholde glukose homeostase ^en. Som avslørt, for eksempel ved viktigheten av ekstracellulære EPHA-ephrinA og neuroligin-2 interaksjoner i reguleringen av glukose-stimulert insulin sekresjon, er det blitt stadig mer klart at økt kunnskap om de ekstracellulære interaksjoner oppstår mellom proteiner på overflaten av tilstøtende beta-celler vil være av stor betydning for å få en full forståelse av insulinsekresjon, beta-celle funksjonell modning og opprettholdelse av glukosehomeostase ^1-3. Målet med metoden beskrevet her er at undersøkelser av effekter på beta celle funksjon av transcellular interaksjoner som involverer spesifikke transmembran eller på annen måte-celle-overflate-assosierte proteiner. Ved co-dyrking betacellene med HEK293 celler transfektert med forskjellige uttrykk konstruksjoner, effekter på beta celle funksjon av forskjellige celle-overflateproteiner eller muterte varianter derav, kan effektivt bli probet. Dette oppnås uten å transfektere betacellene selv.

Klarlegging av rollene til bestemte transcellular interaksjon ved knockdown, knockout eller overexpression studier i dyrkede betacellene eller in vivo nødvendiggjør direkte forstyrrelse av beta-celle mRNA og protein uttrykk, potensielt påvirker beta celle helse og / eller funksjon på måter som kan forvirrer analyser av virkningene av spesifikke ekstracellulære interaksjoner. Disse tilnærmingene også endre nivåene av de intracellulære domenene til de målrettede proteiner og, videre, tillater ikke effekter på grunn av interaksjonen mellom proteiner på eller i den samme celle som skal skilles fra virkningene av transcellular interaksjoner. Her er en fremgangsmåte for å bestemme virkningen av bestemte transcellular interaksjoner på insulin-utskillende kapasitet og responsen til betaceller beskrIBED. Metoden kan anvendes for insulin-sekresjon beta-cellelinjer, slik som INS-1 celler ^4, og til dissosiert primære gnager eller humant beta-celler. Den er basert på coculture modeller utviklet av neurobiologists, som fant at eksponering av dyrkede nerveceller til spesifikke nevrale proteiner uttrykt på HEK293 (eller COS) cellelagene kunne identifisere proteiner som driver synapse formasjon ^5,6. Gitt parallellene mellom sekretoriske maskiner av nevrale synapser og av beta-cellene, resonnerte vi at beta-celle funksjon og funksjonelle modning kan være drevet av lignende transcellular interaksjoner ^7-9. For å undersøke disse interaksjoner, har vi utviklet system som er beskrevet heri i hvilke beta-celler er cocultured på et lag av HEK293-celler som uttrykker et protein av interesse ^10.. Dette systemet gjør at beta-cellen cytoplasma å forbli urørt mens ekstracellulære protein-protein interaksjoner er manipulert.

Protocol

En. Transfeksjon av HEK293 Layer Forbered HEK293 celler medium ved å tilsette til 500 ml flasker med DMEM (med 4,5 g / ml glukose og fenolrødt og uten glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin-løsning, 5 ml 100 x L-glutamin-løsning og 500 mL amphotericin B. Plate ut HEK293 celler i et 24-brønners plate med 0,5 ml HEK293 media per brønn. Sikre at cellene er jevnt fordelt over bunnen av platen. Når HEK293 celler når 100% konfluens, transfektere med 0,8 ug av plasmid k…

Representative Results

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet her, har vi testet effekten av forskjellige varianter av proteinet neuroligin på insulinsekresjon. Dette utfyller vår publiserte arbeider undersøker effekten av neuroligin-2 på beta-celle funksjon 10. Figur 2, for eksempel, viser resultatene fra coculturing INS-1 beta celler med HEK293 celler transfektert å uttrykke en neuroligin isoform referert til her som NL- X. Dette eksperimentet er designet for å teste hypotesen om at NL-X engasjerer seg i …

Discussion

Den coculture metoden beskrevet her gir en effektiv måte for å bestemme den fysiologiske betydningen av bestemte beta-celle-overflate, transmembrane proteiner, og spesielt av deres ekstracellulære domener. Ved dyrking av betaceller eller insulinoma celler (slik som de Ins-1 celler anvendt her) som er i kontakt med HEK293-celler som viser et protein av interesse på celleoverflaten, kan eksperimenter være utformet for å fastslå effekten av ekstracellulære protein-protein interaksjoner direkte uten å forstyrre den…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278