Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Summary

Transcellulaire eiwit interacties zijn belangrijke determinanten van beta-cel functie. Hier beschreven is een methode-aangepast van een co-cultuur model van synaptogenesis-voor het onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten beïnvloeden insuline secretie. Getransfecteerde HEK293 cellen brengen eiwitten van belang; beta-cellen hoeven niet te worden getransfecteerd of anderszins direct verstoord.

Abstract

Interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van de functie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen pancreaseilandjes en handelen op een gecoördineerde wijze aan glucose-homeostase te behouden. Het wordt steeds duidelijker dat interacties tussen transmembraan eiwitten op het oppervlak van de aangrenzende bètacellen zijn belangrijke determinanten van bèta-celfunctie.

Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta-cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van de effecten zou kunnen verwarren specifieke interacties. Deze benaderingen verandert ook het niveau van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en kunnen effecten als gevolg van interacties tussen eiwitten voorkomen binnen dezelfde celmembraan te distinguished tegen de gevolgen van transcellulaire interacties.

Hier een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen gepresenteerd. Deze methode is toepasbaar voor beta-cellijnen, zoals INS-1-cellen, en gedissocieerde primaire bètacellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen geïdentificeerde eiwitten belangrijk voor een synapsvorming gevonden. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat beta-cel functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties. We hebben een systeem ontwikkeld waarbij beta-cellen worden gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse. In dit model wordt de beta-cel cytoplasma onaangeroerd terwijl extracellulair eiwit-eiwit Interactiens worden gemanipuleerd. Hoewel wij hierbij voornamelijk richten op studies van glucose-gestimuleerde insuline secretie, kunnen andere processen worden geanalyseerd, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie bepaald door immunoblotting of qPCR.

Introduction

We beschrijven hier een methode om onderzoeken hoe de extracellulaire domeinen van transmembraan proteïnen specifieke invloed insulinesecretie vergemakkelijken. De werkwijze probes de effecten van interacties van het eiwit van belang met eiwitten (of mogelijk andere moleculen) op de beta-cel oppervlak. De werkwijze maakt onderzoeken hoe celoppervlak eiwitten door beta-cellen of andere naburige cellen (bijv. endotheelcellen, neuronen, pancreas alfa-cellen) tot expressie beïnvloeden beta-celfunctie door transcellulaire interacties (dat wil zeggen door interactie met interactiepartners op het oppervlak van aangrenzende beta-cellen).

De cellulaire plasmamembraan bevat een complexe reeks van structurele en functionele eiwitten dienen als brug de extracellulaire omgeving. Door de vorming van transcellulaire aansluitingen of door initiatie van plastic signalering evenementen, kunnen interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van defunctie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen de alvleesklier eilandjes en op een gecoördineerde wijze als glucose homeostase ¹ te behouden. Zoals geopenbaard, bijvoorbeeld door het belang van extracellulaire EphA-ephrinA en neuroligin 2-interacties in de regulatie van glucose-gestimuleerde insuline secretie, wordt steeds duidelijker dat betere kennis van de extracellulaire interactie optreedt tussen eiwitten op de oppervlakken van aangrenzende bètacellen zal van groot belang zijn voor het verkrijgen van een volledig begrip van de insuline secretie, beta-cel functionele rijping en het onderhoud van de glucose homeostase ^1-3. Het doel van de hier beschreven methode voor onderzoek naar de effecten mogelijk over beta-celfunctie van transcellulaire interacties van specifieke of anderszins transmembraan-celoppervlak-geassocieerde eiwitten. Door co-kweken van beta-cellen met HEK293 cellen getransfecteerd met verschillende expressie constructen, de effecten op de beta celfunctie verschillende celoppervlak eiwitten of gemuteerde varianten daarvan kan efficiënt worden onderzocht. Dit wordt bereikt zonder dat de bètacellen zelf transfecteren.

Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van beta-cel mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van zou kunnen verwarren de effecten van specifieke extracellulaire interacties. Deze zal ook veranderen niveaus van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en verder geen effecten door interacties tussen eiwitten in of in dezelfde cel worden onderscheiden van de effecten van transcellulaire interacties mogelijk. Hier wordt een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen described. Deze methode is toepasbaar voor insuline-afscheidende bèta-cellijnen, zoals INS-1 cellen ^4, en gedissocieerde primaire knaagdieren of humane B-cellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen gevonden kunnen eiwitten die drive synapsvorming ^5,6 identificeren. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat bèta-celfunctie en functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties ^7-9. Om deze interacties probe, we de hierin beschreven waarin betacellen tezamen gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse ¹⁰ ontwikkeld. Dit systeem maakt het beta-cel cytoplasma onaangetast blijven terwijl extracellulair eiwit-eiwit interacties worden gemanipuleerd.

Protocol

1. Transfectie van HEK293 Layer Bereid HEK293 celmedium door aan 500 ml flessen DMEM (met 4,5 g / ml glucose en fenolrood en zonder glutamine): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicilline / streptomycine-oplossing, 5 ml 100x L-glutamine-oplossing en 500 pi amfotericine B. Plaat uit HEK293 cellen in een 24-wells plaat met 0,5 ml HEK293 media per putje. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld over de bodem van de plaat. Wanneer HEK293 cellen 100% samenvloeiing bereiken, transfecteren met …

Representative Results

Als hier beschreven, hebben we het effect van verschillende varianten van de proteïne neuroligin op insulinesecretie getest. Dit vult onze gepubliceerde werk wordt de invloed van neuroligin 2-on beta-celfunctie 10. Figuur 2, bijvoorbeeld, toont resultaten van coculturing INS-1 beta-cellen HEK293 cellen getransfecteerd met een expressie neuroligin isovorm hier aangeduid als NL- X. Dit experiment werd ontworpen om de hypothese dat NL-X transcellulaire bezighoudt met interacties verhogen insuli…

Discussion

De co-cultuur hier beschreven methode een effectieve manier om de fysiologische betekenis van specifieke beta-celoppervlak transmembraan eiwitten bepalen en specifiek hun extracellulaire domeinen. Door kweken beta cellen of insulinoma cellen (zoals de INS-1 cellen zijn hier toegepast) in contact met HEK293 cellen die een eiwit van belang op het celoppervlak, kan experimenten om de effecten van extracellulair eiwit-eiwit interacties bepalen zonder direct verstoren het intracellulaire milieu van de cellen. Omdat de eiwitt…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278