פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית
Summary
השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.
Abstract
חקירת הגנום בקנה מידה של תפקוד גן באמצעות התערבות RNA (RNAi) טומנת בחובו הבטחה עצומה לזיהוי המהיר של נקודות תורפה של תאי סרטן כימי ממושמע. הגבלת הפוטנציאל של טכנולוגיה זו היא חוסר היכולת לשרטט במהירות את הבסיס המכאני של תוצאות פנוטיפי ובכך להודיע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות מולקולרי. אנו מתארים כאן שיטות לפרק פנוטיפים סלולריים הנגרמים על ידי גן RNAi בתיווך מיקוד באמצעות מערכות כתב מרובבות המאפשרות ניטור של סרטן מפתח תא תהליכים הקשורים. המתודולוגיה גבוהה הקרנת תוכן זה היא תכליתית וניתן להתאים בקלות להקרנה של סוגים אחרים של ספריות מולקולריות גדולות.
Introduction
מגוון של כתבים מבוססי לוציפראז לניטור מערך מגוון של תהליכים ביולוגיים סלולריים זמין באופן מסחרי. רוב ה-DNA מקודדים חלבונים אלה בונה לוציפראז הנגרמים על ידי גירויים להביע תאים ספציפיים, טרידות. הכתבים מבוססי תעתיק החזקים ביותר למקם את הביטוי של אנזים לוציפראז תחת השליטה של אלמנטים משפר סינטטיים או אזורי גנים האמרגן מבוססים היטב לאמינות שלהם בדיווח 1,2 אירוע תעתיק רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ישנן גם מערכות טרנס כתב לוציפראז לנצל GAL4-כטב"מ לנהוג ביטוי לוציפראז חלבון. Gal4 הוא שמרי activator תעתיק ואת כטב"מ הוא משפר לGal4 שנקשר באופן ספציפי כדי להפעיל את השעתוק של רצפי גנים שהונחו במורד זרם שלו 3. של מערכות לוציפראז סוגים אלה נתמכים בדרך כלל על ידי שני פלסמידים DNA – אחד מקודד את חלבון GAL4 התמזג regulatoחלק ר"י של חלבון של עניין, והשנייה מקודדת חלבון לוציפראז להציב תחת שליטתו של אחד או יותר רצפי כטב"מ. לפיכך, אות לוציפראז הסלולרית משקפת את רמת הפעילות של החלבון של עניין. שימוש נפוץ נוסף של כתבים מבוססי לוציפראז הוא לניטור יציבות חלבון לפי חלבון של עניין הוא קבע את אנזים לוציפראז 4. ללא קשר לסוג של כתב, ייזהר קונה יצוין כאן כאחד לא יכול להניח את הספציפיות של כל כתב שנחקר היטב. לפיכך, נדרשת בדיקה נאותה בשילוב של כתב בונה חדשה בכל אסטרטגית מחקר.
הבחירה של האנזים לקריאה מתוך לוציפראז יכולה להיות חשובה כמו האמינות של מרכיבי ה-DNA השולטים הביטוי שלה. בעוד גחלילית לוציפראז (פלורידה) הוא האנזים הנפוץ ביותר במבנים מסחריים זמינים, הופעתו של כתב בלוציפראז מערכות חדשות שאינם דורשות ATP (כמו במקרהשל תגובות מבוססות FL) או שישלבו אנזימים יציבים יותר שפולטים אותות חזקים יותר מבטיחים לשפר את היעילות והאמינות של פלטפורמת מחקר זה. הערה חשובה בנוגע לבחירה של כתבי לוציפראז במחקרים כימיים היא הרגישות של פלורידה לעיכוב כימי שעלולים לגרום לדיווח כוזב. מניסיוננו, אנזימים אחרים כגון Renilla או Gaussia לוציפראז (RL וGL, בהתאמה) המנצלים coelenterazine כמצע הם פחות בקלות מעוכב על ידי מולקולות קטנות 5.
הפורמט הנפוץ ביותר לקריאת פסקי לוציפראז ריבוב כרוך בשימוש בפלורידה וRL במידה רבה ניתנה זמינות של ערכות קלות לשימוש, עם היכולת לאמוד את הפעילות אנזימטית ברצף ממדגם יחיד. ברוב ערכות, דגימות ראשונה נחשפות לluciferin כדי לחשוף רובדי פעילות פלורידה ואחריו מגיב מרווה שהופקדה בו זמנית עם coelenterazine להניב seconאות RL Dary. עם התוספת של luciferases אחר שיכול להיות מופרש כמו GL או שימוש שעוד מצע כגון Cypridina לוציפראז (CL), מספר רב יותר של אפשרויות ליצירת תוכן נתונים גבוהים באמצעות luciferases צמחו. ניתן למצוא דוגמה למסך הגנום RNAi באמצעות טכניקה זו כאן 6. יש התקדמות הטכנולוגית אלה בתורו דרבן את הפיתוח של מנגנונים ספציפיים כדי להרוות כל סוג של אנזים לוציפראז על מנת להגביל צולבת שיחה 7. בידיים שלנו, נציין, תדירות גבוהה יותר של "השפעות קצה" (מגמות בלתי מוסברות בפעילות תאית קשורה לקצה של תרבות צלחות כייל נוגדנים גבוהות), עם luciferases המופרש כמו GL או CL. מצד השני, luciferases מופרש כאלה הם שימושיים עבור מבחני קינטיים כפי שהם מאפשרים דגימה של אות ללא adulterating כדאיות תא.
לצורך המחקר שלנו הציג כאן, אנחנו בו זמנית יהיו לפקח על הפעילות של שלושה סרטן רלוונטיתהליכים תאיים: p53, KRAS, ומסלולי העברת אותות Wnt. הכתבים שולבו במחקר שלנו הם כתב pp53-ת"א לוק פלורידה מClontech (יקרא להלן ככתב p53-FL) 8, מערכת כתב Elk1-GAL4/UAS-CL (להלן כתב Elk-1; Agilent), וכתב 8X TCF RL שמשלב אלמנטים משפר סינטטיים מרובים המוכרים על ידי הרגולטורים תעתיק Wnt המסלול הידועים כגורמי T-cell (או TCFs) 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר ספקים של מערכות כתב המבוססים על לוציפראז (כגון Promega, מיקוד מערכות, ניו אינגלנד Biolabs, ותרם פישר) המספקים משאבים מקוונים שימושיים עבור אלה משעשעים מסך תפוקה גבוהה בפעם הראשונה. בנוסף, מספר ביקורות מצוינות לגבי ייעול השימוש במסכי תפוקה גבוהה לגילוי הגן ואיך RNAi מ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה במימון מCPRIT (RP100119) וקרן וולש (I-1665).
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
Referências
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Lum, L. D., Kulak, O. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- . Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
