培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム
Summary
細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。
Abstract
RNA干渉（RNAi）を使用して、遺伝子機能のゲノムスケールの尋問は、化学的に扱いやすい癌細胞の脆弱性の迅速な同定のための途方もない可能性を秘めています。この技術の可能性を制限することで、迅速に結果の表現型の基本メカニズムを描くため、分子標的治療戦略の開発を知らせることができないことである。私たちは、ここで重要な癌細胞関連のプロセスを監視できるように多重化されたレポーターシステムを用いた標的RNAiによる遺伝子によって誘導される細胞の表現型を解体するためのメソッドの概要を示します。このハイコンテントスクリーニング方法は汎用性があり、容易に大規模な分子ライブラリの他のタイプのスクリーニングに適合させることができる。
Introduction
細胞生物学的プロセスの多様な配列を監視するためのルシフェラーゼに基づくレポーターの様々な市販されている。これらのDNAの大部分は、特定の細胞の刺激や摂動によって発現するように誘導されているルシフェラーゼタンパク質をコードする構築。最も堅牢な転写基づい記者は生理学的に関連する転写イベント1,2の報告では、その信頼性のために十分に確立された合成エンハンサーエレメントまたは遺伝子プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ酵素の発現を配置。ルシフェラーゼタンパク質の発現を駆動するためGAL4-UASを利用するトランス – ルシフェラーゼレポーターシステムも存在する。 GAL4は、酵母転写活性化因子であり、UASは、Gal4のは、特にそれ3の下流に配置された遺伝子配列の転写を活性化するために結合するエンハンサーである。ルシフェラーゼこれらのタイプのシステムは、典型的には、2つのDNAプラスミドに支持されている – オンはregulatoに融合GAL4タンパク質をコードするリュー目的のタンパク質の部分と、第二は、1つまたは複数のUAS配列の制御下に置かれたルシフェラーゼタンパク質をコードする。したがって、セルラルシフェラーゼシグナルは目的のタンパク質の活性レベルを反映する。ルシフェラーゼベースのレポーターの別の一般的な用途は、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素4に融合させたタンパク質の安定性を監視するためのものです。一つはよく尋問されたため、任意のレポーターの特異性を仮定することはできませんように関係なく、レポーターのタイプの、買い主の危険負担は、ここで注目される。したがって、デューデリジェンスは、任意の研究戦略における新たなレポーター構築の組み込みが必要になります。
ルシフェラーゼ酵素読み出しの選択は、その発現を制御するDNAエレメントの信頼性と同じくらい重要になることがあります。ホタルルシフェラーゼ（FL）は、市販の構成要素の中で最も一般的に使用される酵素であるのに対し、（場合のようにATPを必要としない新しいルシフェラーゼレポーターシステムの出現FLベースの反応）またはより強いシグナルを発する組み込むより安定した酵素は、この研究プラットフォームの効率と信頼性を向上させることを約束します。その化学研究でルシフェラーゼレポーターの選択に関する重要な注意事項は、虚偽の報告を生じさせる可能性があり、化学阻害にFLの感受性である。我々の経験では、そのようなウミや基質としてセレンテラジンを利用ガウルシフェラーゼ（それぞれRLとGL、）のような他の酵素が少なく容易に小分子5によって阻害される。
多重化ルシフェラーゼリードアウトのための最も一般的な形式は、主に単一のサンプルから順次に酵素活性を測定する機能を簡単に使用できるキットの利用可能性を与えFLとRLの使用を伴う。ほとんどのキットにおいて、サンプルは、最初に同時にseconを得セレンテラジンを用いて堆積される消光用試薬が続くFL活性のレベルを明らかにするルシフェリンにさらされているDARY RL信号。例えばウミホタルルシフェラーゼ（CL）のようなさらに別の基板GL、またはその用途として分泌され得る他のルシフェラーゼを添加して、ルシフェラーゼを用いた高コンテンツデータを生成する可能性がより多くの数が浮上している。この技術を用いたゲノムワイドRNAiスクリーニングが6ここで見つけることができた例。これらの技術的進歩は、順番に、クロストーク7を制限するために、ルシフェラーゼ酵素の各タイプをクエンチするために特定のメカニズムの開発に拍車をかけた。私たちの手で、私たちはそのようなGLやCLなどの分泌ルシフェラーゼと、 "エッジ効果"（高力価の培養プレートのエッジに関連する細胞活動の不可解な傾向）の大きい周波数に注意してください。それらは、細胞生存率をadulteratingずに信号サンプリングを可能にするように、その一方で分泌ルシフェラーゼ、運動アッセイに有用である。
ここで紹介する私たちの研究では、我々は同時に3癌関連のアクティビティを監視します細胞プロセス：p53を、Krasの、及びWntシグナル伝達経路。 、、我々の研究に組み込まれた記者はクロンテックからPP53-TA-リュックFLレポーター（以下のp53-FL記者と呼ぶ）8、Elk1-GAL4/UAS-CLレポーター系（アジレント以後エルク-1レポーター）であるおよびT細胞因子（またはのTCF）9-11として知られるWnt経路転写調節因子によって認識され、複数の合成エンハンサー要素を取り入れ8X TCF RLレポーター。
Protocol
Representative Results
Discussion
初めてのハイスループットスクリーンを楽しま人のために便利にオンラインリソースを提供ルシフェラーゼベースのレポーターシステムのいくつかの御用達（例えば、プロメガ、ターゲットシステム、New England Biolabs社、及びサーモフィッシャーなど）があります。また、遺伝子の発見と方法のRNAiベースのスクリーニング結果は、他の-オミクスベースのデータセットを統合することができる?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はCPRIT（RP100119）とウェルチ財団（I-1665）からの資金支援を認める。
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
Referências
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