نقص التروية Photothrombotic: A الضوئية نموذج الآفات القشرية المناظير وقابلة للتكرار للدراسات السكتة الدماغية ماوس
Summary
Photothrombosis هو وسيلة سريعة وتقنية الحد الأدنى الغازية لإحداث احتشاء الصغيرة وكذلك بفواصل في المجالات ذات الاهتمام بطريقة استنساخه للغاية. انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
ويهدف نموذج السكتة الدماغية photothrombotic للحث على الأضرار الدماغية داخل منطقة القشرية يعطى عن طريق الصور تفعيل صبغة حساسة للضوء حقن سابقا. بعد إضاءة، يتم تنشيط الصبغة وينتج الأكسجين القميص أن مكونات أضرار من أغشية الخلايا البطانية، مع تراكم الصفائح الدموية وتكوين الجلطات اللاحقة، والذي يحدد في نهاية المطاف انقطاع تدفق الدم المحلية. تم تحسين هذا النهج، اقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977، في وقت لاحق من قبل واطسون في عام 1985 في دماغ الفئران وتعيين أساس النموذج الحالي. أيضا، ساهمت زيادة توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا أخرى لرفع الفائدة على نموذج photothrombosis. لفترة وجيزة، يتم حقن صبغة حساس (روز البنغال) الغشاء البريتونى ويدخل مجرى الدم. عندما تضاء بواسطة مصدر ضوء بارد، يصبح صبغ تنشيط ويدفع الضرر البطانية مع تنشيط الصفائح الدموية وتخثر الدم، مما أدى إلى المحليةتدفق انقطاع الدم. يمكن تطبيقها مصدر الضوء على الجمجمة سليمة مع عدم وجود الحاجة من حج القحف، والذي يسمح استهداف أي منطقة القشرية ذات الاهتمام بطريقة متكررة وغير الغازية. ثم يتم خياطة الماوس وسمح ليستيقظ. تقييم الأضرار الدماغية يمكن أن يتحقق بسرعة عن طريق كلوريد ثلاثي فينيل-تترازوليوم أو الكريزيل تلطيخ البنفسجي. هذه التقنية تنتج احتشاء من صغر حجمها وحدودها جيدا محدد، وهو أمر مفيد للغاية لتوصيف خلية دقيقة أو دراسات وظيفية. وعلاوة على ذلك، انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.
Introduction
في بداية القرن 21th، السكتة الدماغية هو اضطراب المدمر الذي يمثل السبب الثاني للإعاقة على المدى الطويل (1) والسبب الثاني للوفيات في جميع أنحاء العالم، والتي تمثل في السكتة الدماغية لحوالي 5،7 مليون حالة وفاة في عام 2004 2. على الرغم من الجهود العديدة التي وضعت في، لا يوجد حتى الآن علاج فعال المتاحة لتحسين الانتعاش وظيفية بعد السكتة الدماغية. وتستخدم النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية على نطاق واسع في مجال البحث السكتة الدماغية لأنها تسمح النمذجة من الفيزيولوجيا المرضية لنقص تروية الضرر واختبار فعالية استراتيجيات اعصاب مختلفة في الجسم الحي. معظم هذه النماذج تهدف للحث على احتشاء اسعة النطاق عن طريق قطع (مؤقتا أو بشكل دائم) تدفق الدم داخل الشريان الدماغي الأوسط، في حين تم تطوير نماذج أخرى لدراسة آفات صغيرة الحجم في مجالات محددة، وعادة المحرك والقشور الحسية الجسدية. ومع ذلك، قد العديد من العوامل التي تساهم في توليد التيار المتردددرجة ertain من التباين في الدراسات التجريبية السكتة الدماغية، بما في ذلك السلالة الماوس المستخدمة، والعمر والجنس من الحيوانات التي شملتها الدراسة، وقبل كل شيء، اعتمدت تقنية للحث على الأضرار الدماغية. فيما يتعلق بهذه النقطة الأخيرة، ومدة والغازية من عملية جراحية (أي الحاجة إلى حج القحف) فضلا عن مهارة الجراحية اللازمة للمشغل للحث موثوق آفة الدماغية هي العوامل الحاسمة لنجاح وغير متحيزة في الدراسة المجراة السكتة الدماغية .
مفهوم photothrombosis واقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977 3 وأصبحت مشهورة من خلال تطبيقه في دماغ الفئران من قبل واتسون وآخرون في عام 1985 في 4 والتي تم تحسين تقنية إلى حد كبير وتعيين أساس النموذج الحالي 3 – 6. ويهدف النهج photothrombotic للحث على احتشاء القشرية من خلال الصورة تفعيل صبغة حساسة للضوء تسليمها مسبقا في نظام الدم، WHالتراث الثقافي غير المادي يؤدي إلى تخثر الأوعية المحلية في المناطق المعرضة للضوء. عندما يضيء الصبغة المنتشرة في الطول الموجي المناسب من مصدر ضوء بارد، فإنه يطلق الطاقة إلى جزيئات الأكسجين، والتي بدورها تولد كمية كبيرة من الأكسجين شديدة التفاعل منتجات القميص. هذه وسيطة الأكسجين لحث الخلية البطانية بيروكسيد الغشاء، مما يؤدي إلى التصاق الصفائح الدموية وتجميعها، وفي نهاية المطاف إلى تشكيل الجلطة الدموية التي تحدد محلية انقطاع تدفق الدماغي 7.
Photothrombosis هو نموذج الدماغية غير المقبول أن لا تسد الشريان أو كسر واحد فقط كما يحدث عادة في السكتة الدماغية الإنسان، ولكن يحرض الآفات في الأوعية أكثر سطحية، والذي ينتج في انقطاع الانتقائي لتدفق الدم في المناطق المعرضة للضوء. لهذا السبب، قد تكون مناسبة هذا النهج للدراسات الخلوية والجزيئية من اللدونة القشرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية تكمن في بساطته التنفيذ.وعلاوة على ذلك، photothrombosis لا يمكن أن يؤديها بسهولة في ما يقرب من أربعين دقيقة لكل حيوان، بما في ذلك الانتظار عشرين دقيقة (3 دقائق للتخدير؛ 1 دقيقة حلق فروة الرأس؛ 3-5 دقيقة إلى وضع الحيوان على جهاز التجسيمي؛ 2 دقيقة لتنظيف فروة الرأس بمحلول مطهر، وجعل شق وتنظيف الجمجمة؛ 2-4 دقيقة لوضع الألياف الباردة الخفيفة؛ 1 دقيقة لحقن محلول البنغال روز؛ 5 مين الانتظار لنشرها داخل الصفاق؛ 15 دقيقة من الإضاءة؛ و 5 دقائق لل تنظيف الجرح وخياطة الحيوان). وعلاوة على ذلك، ليس هناك حاجة إلى الخبرة الجراحية لأداء هذه التقنية كما هو فعل الآفة من خلال إضاءة بسيطة من الجمجمة سليمة. على عكس انسداد الشرايين الكلاسيكية، ويحدد هذا الأسلوب الانتقائي للانسداد microvessels حنوني وintraparenchymal داخل المنطقة المعرضة للإشعاع ويقلل من التباين بين الآفات كما هو ترك أي سفينة ضمانات لتوريد الأكسجين في المنطقة المستهدفة.
على الرغم من طبيعته وجه الخصوص،أسهم الضرر photothrombotic الآليات الأساسية التي تحدث في الدماغ السكتة الدماغية. وبالمثل لانسداد شريان في المخ البشري، تراكم الصفائح الدموية وتكوين جلطة تحديد انقطاع تدفق الدم في المنطقة المعرضة للإشعاع 7. وبالمثل، وأسهم هذا النموذج أيضا الاستجابات الالتهابية الأساسية كما هو الحال في وسط انسداد الشريان الدماغي 8. ومع ذلك، ونظرا للحدود جيدا ترسيم الرف القاري، والمنطقة الناقص، والتي تتطابق مع مساحة التمثيل الغذائي الحفاظ جزئيا، يتم تخفيض جدا أو منعدمة بعد الآفة photothrombotic. وهذا يمكن أن الحدود واضحة تيسير دراسة الاستجابات الخلوية داخل الدماغية أو سليمة المنطقة القشرية. نموذج الفأر Photothrombosis هو مناسبة خاصة للدراسات السكتة الدماغية في مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا. في الواقع النماذج الكلاسيكية لا يمكن أن يصلح لجميع السلالات والدراسات فترة طويلة في C57BL / 6 اشتكوا من ضغوط الماوس نسبة الوفيات العالية التي يمكن أن تسبب التحيز 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات والتبديلات
بسبب ذروة امتصاصه في 562 نانومتر، ليزر الضوء الأخضر من مصباح قوس الزينون تصفيتها تم اختياره أصلا لأشرق على حساس روز البنغال. على الرغم من الإثارة ليزر بوساطة كانت لا تزال تستخدم recently5، ويمكن أن تحل محلها مصباح ض…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أناليزا بوفو للحصول على اقتراحات بصيرة والتعليقات، وماوريتسيو Grassano، مارينا Boido وإرميرا Pajaj لاطلاق النار. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7-MC-214003-2 (ماري كوري الأولية تدريب شبكة AXREGEN) وكمبانيا دي سان باولو، مشروع gliarep.
Materials
| MATERIAL NAME | COMPANY | CATALOGUE NUMBER | |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made |
Referências
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
- Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
- Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
- Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
- Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090 (2012).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
- Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
- Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic ‘ring’ model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
- Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
- Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
