Photothrombotic Ischemia: en minimal invasiv og reproduserbar fotokjemisk Cortical Lesion Modell for Mouse Stroke Studies

Summary

Photothrombosis er en rask, minimalt-invasiv teknikk for å indusere små og velavgrenset infarkt i områder av interesse i svært reproduserbar måte. Den er spesielt egnet for å studere cellulære og molekylære responser underliggende hjerne plastisitet i transgene mus.

Abstract

Den photothrombotic firetaktsmotor tar sikte på å indusere en iskemisk skade i et gitt kortikale område ved hjelp av foto-aktivering av en på forhånd injisert lysfølsom fargestoff. Etter belysning, blir fargestoff aktivert og produserer singlet oksygen som skader endoteliale komponenter i cellemembraner, med påfølgende blodplate-aggregasjon og tromber formasjon, som til slutt bestemmer den avbrytelse av lokale blodgjennomstrømning. Denne tilnærmingen, først foreslått av Rosenblum og El-Sabban i 1977, ble senere forbedret av Watson i 1985 i rotte hjerne og satt med utgangspunkt i dagens modell. Også den økte tilgjengeligheten av transgene mus linjer ytterligere bidratt til å heve renten på photothrombosis modell. Kort fortalt er en lysfølsom fargestoff (Rose Bengal) injisert intraperitonealt og går inn i blodstrømmen. Når opplyst av en kald lyskilde, blir fargestoff aktivert og induserer endotelisk skade med blodplate-aktivering og trombose, som resulterer i lokalblodstrøm avbrudd. Lyskilden kan påføres på den intakte skallen uten behov av kraniotomi, som tillater målretting av ethvert kortikale område av interesse i en reproduserbar og ikke-invasiv måte. Musen er da sutured og lov til å våkne opp. Evalueringen av iskemisk skade kan raskt gjøres ved trifenyl-tetrazolium klorid eller cresyl fiolett farging. Denne teknikken gir infarkt i liten størrelse og velavgrenset grenser, noe som er svært fordelaktig for nøyaktig karakterisering celle eller funksjonelle studier. Videre er den spesielt egnet for å studere cellulære og molekylære responser underliggende hjerne plastisitet i transgene mus.

Introduction

I begynnelsen av det 21. århundre, er hjerneinfarkt en ødeleggende lidelse som representerer den andre årsaken langsiktig uførhet ¹ og den andre årsaken til dødelighet over hele verden, hvor hjerneslag utgjorde om lag 5,7 millioner dødsfall i 2004 ^2. På tross av de mange tiltak som ble satt inn, er det fortsatt ingen effektiv behandling tilgjengelig for å forbedre funksjonell bedring etter hjerneslag. Dyremodeller for slag er mye brukt innen forskning slag som de tillater modellering av patofysiologien av ischemisk skade og teste effekten av forskjellige strategier nevrobeskyttende in vivo. De fleste av disse modellene tar sikte på å indusere omfattende infarkt ved å avbryte (midlertidig eller permanent) blodstrømmen innen midten cerebral arterie, mens andre modeller ble utviklet for å studere lesjoner av liten størrelse i bestemte områder, typisk motor og somatosensoriske cortices. Imidlertid kan flere faktorer bidrar til å generere acertain grad av variasjon i eksperimentelle hjerneslag studier, inkludert musen stamme brukt, alder og kjønn av dyr som inngår i studiet og, fremfor alt, vedtok teknikk for å indusere iskemisk skade. Med hensyn til det sistnevnte punkt, varigheten og invasivitet av operasjonen (dvs. behovet for en kraniotomi) samt den kirurgiske dyktighet som kreves til operatøren på en pålitelig måte indusere en ischemisk lesjon er kritiske faktorer for en vellykket og objektive in vivo studie slag .

Begrepet photothrombosis ble opprinnelig foreslått av Rosenblum og El-Sabban i 1977 ^tre og ble kjent med sin søknad i rotte hjernen ved Watson et al i 1985 ^fire der teknikken var i stor grad forbedret og satt med utgangspunkt i dagens modell ^{3. – 6.} Den photothrombotic tilnærming tar sikte på å indusere en kortikale infarkt gjennom foto-aktivering av en lys-sensitive fargestoff tidligere levert inn blod system, which resulterer i lokale fartøy trombose i områder utsatt for lys. Når det sirkulerende fargebad belyst ved den passende bølgelengde ved en kald lyskilde, frigjør den energi til oksygenmolekyler, som i sin tur genererer en stor mengde av svært reaktive singlet oksygen produkter. Disse oksygen mellomprodukter indusere endotelisk cellemembran peroksidasjon, som fører til blodplate-adhesjon og aggregering, og til slutt til dannelsen av tromber som bestemmer lokal cerebral strømning avbrudd ^7..

Photothrombosis er en ikke-kanoniske iskemisk modell som ikke occlude ikke eller bryte bare en arterie som det vanligvis skjer i menneskelig slag, men induserer lesjoner i flere overfladiske fartøyer, noe som resulterer i selektiv avbrudd av blodstrøm i de områdene utsettes for lys. Av denne grunn kan denne tilnærmingen være egnet for cellulære og molekylære studier av kortikale plastisitet. Den viktigste fordelen med denne teknikken ligger i sin enkelhet av utførelsen.Videre kan photothrombosis enkelt utføres i omtrent førti minutter per dyr, inkludert tjue minutters vente (3 min for anestesi, 1 min å barbere hodebunnen, 3 til 5 min å plassere dyret på stereotaxic apparater; 2 min å skrubbe hodebunnen med antiseptisk løsning, gjør et snitt og rense skallen, 2-4 min å plassere det kalde lyset fiber, 1 min å injisere rose Bengal løsningen, 5 min-ventetiden for intraperitoneal diffusjon, 15 min av belysning, og 5 min til rense såret og suturere dyr). Videre er ingen kirurgisk kompetanse for å utføre denne teknikken som lesjon er indusert gjennom enkel belysning av den intakte hodeskallen. I motsetning til klassisk arteriell okklusjon, bestemmer denne metoden selektive occlusions av pial og intraparenchymal microvessels innenfor bestrålt sonen og reduserer variasjon blant lesjoner som ingen sivile fartøy som er igjen til å levere oksygen i målrettede området.

På tross av dens spesielle natur,photothrombotic skade aksjer sentrale mekanismene som oppstår i hjerne slag. Tilsvarende til arterieokklusjon i human slag, blodplateaggregering og dannelse av blodpropper bestemme avbrudd av blodstrømmen i det bestrålte området ^7. Likeledes, deler denne modellen også viktige inflammatoriske responser som i midten cerebral arterie okklusjon ^åtte. Imidlertid, på grunn av de godt delimitated grenser, er det penumbral sone, som svarer til et område av delvis bevart metabolisme, meget redusert eller ikke-eksisterende etter en photothrombotic lesjon. Denne klare grensen kan lette studie av cellulære responser innenfor iskemisk eller intakt cortical området. Photothrombosis mus modell er spesielt egnet for slag-studier i en rekke av transgene dyr. Faktisk klassiske modellene ikke får plass til alle stammer og lange perioden studier i C57BL / 6 mus belastning rapportert en høy dødelighet forhold som kan føre til skjevhet ^ni.

Protocol

En. Pre-kirurgi Vei Rose Bengal i et 1,5 ml rør og oppløses i steril saltoppløsning til n en endelig konsentrasjon på 15 mg / ml. Filtrere sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og lagre den i mørke ved romtemperatur i opptil to måneder. Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering. Den kirurgiske området bør renses mindre enn én time før du starter operasjonen. Ta opp musen kroppsvekt for å justere dosen av Rose Bengal som skal injiseres. Vi injisert 10 ul / …

Representative Results

Denne protokollen vil produsere en kortikal lesjon som allerede er synlig ved disseksjon av hjernebarken for det blotte øye (Tall 1A-1C). Den photothrombotic lesjon utvikler seg i overfladiske og dype cortical lagene der vev er tilstrekkelig gjennomsiktig slik at foto-aktivering av Rose Bengal. Måling av omfanget av cerebralt infarkt kan utføres raskt ved histologisk farging med trifenyl-tetrazolium-klorid (TTC) på friskt vev eller av cresyl fiolett etter fiksering i 4% paraformaldehyd (PFA). Før T…

Discussion

Modifikasjoner og erstatninger

På grunn av sin absorpsjon topp på 562 nm, var et grønt lys laser fra en filtrert xenon arc lampe opprinnelig valgt å bestråle den lysfølsomme Rose Bengal. Selv om laser-mediert eksitasjon ble fortsatt brukt recently5, kan det bli erstattet av kaldt lys lampe som også sikrer fargestoff eksitasjon ^10,15. Kaldt lys optiske fibre er lettere å manipulere og rimeligere enn laserkilder. Imidlertid bør det bli lagt merke til at lasere er vanligvis bru…

Materials

MATERIAL NAME	COMPANY	CATALOGUE NUMBER
			Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
			Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made