Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies
Summary
Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.
Abstract
Die photothrombotic Hubmodell zielt auf eine ischämische Schädigung innerhalb einer bestimmten kortikalen Bereich mittels Foto-Aktivierung eines zuvor injizierten lichtempfindlichen Farbstoff induzieren. Nach der Belichtung wird der Farbstoff aktiviert und Singulett-Sauerstoff, die Schäden Komponenten Endothelzellen Membranen mit anschließender Thrombozytenaggregation und Thrombenbildung, die schließlich bestimmt, die Unterbrechung der lokalen Durchblutung. Dieser Ansatz, der ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 vorgeschlagen, wurde später von Watson im Jahr 1985 verbesserte sich im Rattenhirn und stellen die Grundlage für das aktuelle Modell. Auch die zunehmende Verfügbarkeit von transgenen Mauslinien weiter dazu beigetragen, das Interesse an der Photothrombose Modell zu erhöhen. Kurz gesagt, wird eine lichtempfindliche Farbstoff (Rose Bengal) intraperitoneal injiziert und gelangt in den Blutkreislauf. Wenn von einer Kaltlichtquelle beleuchtet wird, wird der Farbstoff aktiviert und induziert Endothelschädigung mit Thrombozytenaktivierung und Thrombose, was zu lokalenBlutfluss Unterbrechung. Die Lichtquelle kann auf dem intakten Schädel ohne Notwendigkeit der Kraniotomie, die ein Targeting jeder kortikalen Bereich von Interesse in einer reproduzierbaren und nicht-invasive Art und Weise angewendet werden können. Die Maus wird dann vernäht und erlaubt aufzuwachen. Die Auswertung der ischämischen Schädigung schnell von Triphenyl-Tetrazoliumchlorid oder Kresylviolett Färbung durchgeführt werden. Diese Technik erzeugt Infarkt der geringen Größe und gut abgegrenzt Grenzen, was sehr vorteilhaft für die präzise Charakterisierung Zelle oder funktionelle Studien ist. Weiterhin ist es besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.
Introduction
Zu Beginn des 21. Jahrhunderts, ist ischämischem Schlaganfall eine verheerende Krankheit, die die zweite Ursache für langfristige Behinderung 1 und die zweithäufigste Todesursache weltweit, in denen Schlaganfall etwa 5,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2004 entfielen 2 darstellt. Trotz der vielen Anstrengungen, die gesetzt wurden in, gibt es noch keine wirksame Behandlung zur Verfügung funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall verbessern. Tiermodelle von Schlaganfall sind weit verbreitet im Bereich der Hub Forschung verwendet, da sie Modellierung der Pathophysiologie des ischämischen Schadens und damit Prüfung der Wirksamkeit verschiedener neuroprotektive Strategien in vivo. Die meisten dieser Modelle sollen umfangreiche Infarkte durch Unterbrechung (vorübergehend oder dauerhaft) den Blutfluss in der Arteria cerebri media, während andere Modelle wurden entwickelt, um Läsionen der geringen Größe in bestimmten Bereichen, in der Regel der Motor und somatosensorischen Kortex studieren zu induzieren. Allerdings können mehrere Faktoren beitragen, ac erzeugenn eingetragen Maß an Variabilität in experimentellem Schlaganfall Studien, einschließlich der Maus-Stamm verwendet, dem Alter und Geschlecht der Tiere in die Studie eingeschlossen und vor allem hat die Technik, um die ischämische Schädigung induzieren. Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt, der Dauer und Invasivität der Operation (dh die Notwendigkeit einer Kraniotomie) sowie der chirurgischen Geschick erforderlich, um den Bediener zuverlässig induzieren einen ischämischen Läsion sind kritische Faktoren für eine erfolgreiche und unvoreingenommene in vivo Studie Schlaganfall .
Das Konzept wurde ursprünglich von Photothrombose Rosenblum und El-Sabban 1977 3 vorgeschlagen und wurde berühmt durch ihre Anwendung im Rattenhirn von Watson et al 1985 4, in dem die Technik wurde weitgehend verbessert und stellen die Basis des aktuellen Modells 3. – 6. Die photothrombotic Ansatz zielt auf eine kortikale Infarkt durch die Foto-Aktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoff zuvor in Blutsystem, wh geliefert induzierenich ergibt lokalen Gefäß Thrombose in den Bereichen die dem Licht ausgesetzt. Wenn der zirkulierenden Farbstoff bei der geeigneten Wellenlänge wird von einer Kaltlichtquelle beleuchtet, gibt es Energie, um Sauerstoff-Moleküle, die wiederum erzeugen eine große Menge von hochreaktiven Singulettsauerstoff Produkte. Diese Sauerstoff-Zwischenstufen induzieren Endothelzellmembran Peroxidation führt zu Blutplättchen-Adhäsion und-Aggregation und schließlich zur Bildung von Thromben lokalen zerebralen Flussunterbrechung 7 zu bestimmen.
Photothrombose ist ein nicht-kanonischen ischämischen Modell, das nicht verstopfen nicht oder brechen nur eine Arterie, wie es geschieht in der Regel in der menschlichen Schlaganfall, sondern induziert Läsionen in mehr oberflächlichen Gefäße, die in selektive Unterbrechung des Blutflusses in den Bereichen Licht ausgesetzt ergibt. Aus diesem Grund kann dieser Ansatz für Zell-und molekularbiologische Untersuchungen der kortikalen Plastizität. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit der Ausführung.1 min, um die Kopfhaut rasieren;; 3-5 min, um das Tier auf der stereotaktischen Gerät zu platzieren; Darüber hinaus können Photothrombose leicht in ca. 40 Minuten pro Tier, einschließlich zwanzig Minuten Wartezeit (3 min für Anästhesie durchgeführt werden 2 min auf die schrubben Kopfhaut mit einer antiseptischen Lösung, einen Einschnitt machen und reinigen Sie den Schädel; 2 bis 4 min, um die kalte Licht Faser platzieren; 1 min bis die Rose Bengal Lösung zu injizieren; 5 Minuten Wartezeit für die intraperitoneale Diffusion; 15 min von Beleuchtung und 5 min auf Reinigen Sie die Wunde und Naht das Tier). Darüber hinaus ist keine chirurgische Know-how benötigt, um diese Technik durchzuführen, wie die Läsion durch einfache Beleuchtung des intakten Schädel induziert wird. Im Gegensatz zu klassischen Arterienverschluss Diese Methode ermittelt selektive Verschlüsse Pia und intraparenchymal microvessels innerhalb der bestrahlten Zone und verringert die Variabilität unter Läsionen keine Sicherheiten Behälter gelassen wird Sauerstoff in dem Zielgebiet zu liefern.
Trotz seiner besonderen Art, derphotothrombotic Schäden Aktien wesentlichen Mechanismen auftretenden Hirnschlag. Ähnlich wie in der menschlichen Arteria Schlaganfall bestimmen Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung Unterbrechung des Blutflusses in der bestrahlten Fläche 7. Ebenso auch dieses Modell teilt wesentliche Entzündungsreaktionen wie in Mitte Zerebralarterie 8. Da jedoch der gut abgegrenzt Grenzen ist die Penumbra-Zone, die zu einem Bereich des teilweise erhaltenen Stoffwechsel entspricht, sehr reduzierten oder existiert nach einem photothrombotic Läsion. Diese klare Grenze kann die Untersuchung von zellulären Reaktionen innerhalb ischämischen oder intakten kortikalen Bereich zu erleichtern. Photothrombose Mausmodell eignet sich besonders für Untersuchungen Hub in eine Vielzahl von transgenen Tieren. Tatsächlich klassischen Modelle können nicht an allen Stämmen und längere Studien in C57BL / 6 Maus-Stamm berichtet eine hohe Sterblichkeit Verhältnis, das Bias 9 führen kann passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifikationen und Substitutionen
Wegen seiner Absorptions-Peak bei 562 nm, wurde ein grünes Licht Laser aus einer gefilterten Xenonbogenlampe ursprünglich gewählt, um die lichtempfindliche Rose Bengal bestrahlen. Obwohl Laser-vermittelte Erregung wurde noch recently5 verwendet, kann es durch Kaltlichtlampe ersetzt werden, auch dafür sorgen, Farbstoffanregung 10,15. Kaltlicht optischen Fasern sind leichter zu manipulieren und weniger teuer als Laserquellen. Es sollte jedoch bemer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Annalisa Buffo für aufschlussreiche Anregungen und Kommentare, und Maurizio Grassano, Marina Boido und Ermira Pajaj für die Dreharbeiten. Diese Arbeit wurde von FP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) und der Compagnia di San Paolo, gliarep Projekt finanziert.
Materials
| MATERIAL NAME | COMPANY | CATALOGUE NUMBER | |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made |
Referências
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