Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em> Arabidopsis THALIANA</em> Семена
Summary
Мы сообщаем эффективный и простой способ, чтобы изолировать эмбрионов на ранних стадиях развития от<em> Arabidopsis THALIANA</em> Семена. До 40 эмбрионы могут быть выделены в 1 часа до 4 часов, в зависимости от вниз по течению приложения. Процедура подходит для транскриптом, метилирование ДНК, экспрессия гена-репортера, иммунной и флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизации анализов.
Abstract
У цветковых растений, зародыш развивается в питательной ткани – эндосперма – окруженный материнской покровов семян (или семенной оболочки). Как следствие, изоляция растение эмбрионов на ранней стадии (1 клетки шаровидный этап) является технически сложной задачей из-за их относительной недоступности. Эффективное рассечение ручной на ранних стадиях сильно ухудшается малого размера молодые семена Arabidopsis и адгезивность эмбриона на окружающие ткани. Здесь мы описываем способ, который позволяет эффективно изоляции молодых эмбрионов Arabidopsis, дающие до 40 эмбрионов в 1 часа до 4 часов, в зависимости от вниз по течению приложения. Эмбрионы высвобождаются в изоляции буфер, слегка 250-750 дробление семян с пластиковой пестиком в пробирку Эппендорфа. Стакан микрокапилляра установки либо в стандартных лабораторных пипетки (через резиновую трубку) или гидравлическим управлением микроинъектор используется для сбора эмбрионов из капель местеD на мульти-и слайд на инвертированный микроскоп свет. Технических навыков, необходимых просты и легко переносятся, а основная установка не требует дорогостоящего оборудования. Сборник эмбрионы подходят для различных последовательных применений, таких как ОТ-ПЦР, РНК последовательности, анализ метилирования ДНК, флуоресценции в гибридизация (FISH), иммунные и анализы гена-репортера.
Introduction
Зародыш цветковых растений окружен эндоспермом, питательные ткани, полученные из второго события оплодотворения. Оба зародыша и эндосперма окружены несколько слоев клеток семенной кожуры. Взятые вместе, эти ткани образуют семена, которые развиваются внутри плода. Таким образом, ткани и клетки конкретных анализов Arabidopsis эмбрионы сильно обесцененные из-за их недоступности. Тем не менее, эмбрионов на поздних шаровидные или более поздних стадиях, относительно хорошо поддаются ручной вскрытия с помощью тонкой иглы вольфрама под стереомикроскоп или слегка надавив на семенах с помощью щипцов, чтобы извлечь их. Такие методы были успешно использованы для транскриптома или эпигенома анализы профилирования, такие как гибридизация микрочипов, бисульфит секвенирование, или РНК последовательности (например, 1-3). Напротив, исследования эмбрионов на ранних зиготы до шаровых этапе остаются технически сложными. На сегодняшний день только несколько исследований Reported транскриптома анализы на молодых эмбрионов с использованием либо лазерным захватом микродиссекции (LCM) эмбриональных тканей со стационарных разделов семян 4 или ручного извлечения отдельных эмбрионы изнутри семена с использованием тонких инструментов 5. Тем не менее, LCM оборудования, что является невозможным и ручное извлечение эмбрионов на ранних стадиях является трудоемким и требует отличные навыки вскрытия, которые не легко передаваться. В дополнение к генома анализы, на месте анализ экспрессии генов, также трудно выполнить на молодых, целом монтажа эмбрионов Arabidopsis. В некоторой степени, молодые эмбрионы могут быть выпущены на предметные стекла микроскопа путем осторожного давления на семена и используется для анализа репортерного гена или белка обнаружения иммунного (см., например, 6,7). Этот метод, однако, не дает высокую пропускную способность эмбриона изоляции, препятствуя тем самым количественного анализа.
Поэтому мы разработали эффективный и быстрый протоколдля раннего эмбриона изоляции от семян Arabidopsis, который прост в настройке, легко переносятся, и подходит для различных последующих применений. Основной принцип состоит, чтобы аккуратно раздавить семена – вырезали у молодых стручки в пробирку Эппендорф с помощью пластикового пестика в соответствующем буфере изоляции. Экстракт семян помещают в капли на мульти-и слайдов и подвергают скринингу на присутствие выпущен эмбрионов в нужной стадии с использованием инвертированного микроскопа. Эмбрионы собирали с использованием стекла микрокапилляра прикреплен к микроинъектор или стандартный пипетки лаборатории. Для молекулярных приложений, эмбрионы дважды промывали повторяется релиз в капли новый буфер изоляции до их передачи на буфер назначения в минимальном объеме. Для цитологических приложения (репортер анализы, иммунное, FISH), стадий промывки может быть опущен.
Метод имеет ряд преимуществ: (I) он дает 25-40 эмбрионов в ~ 45 мин для цитологического приложенияликаций или через 3-4 часа для молекулярной приложений (в том числе этапов промывки), (II) она позволяет выделение специфических эмбриональных стадиях, (III) это легко передаваться другим лицам и лабораторий благодаря простоте установки, (IV) она требуется доступное по цене оборудование для базовые настройки, которые поддается модернизации, и (V) он был успешно использован для различных последовательных применений, таких как РНК последовательности 8, ген-специфических ДНК-анализа метилирования 9, репортер анализы (10 и Raissig соавт., в стадии подготовки.) и рыба (J. Jaenisch, У. Grossniklaus, С. Baroux неопубликованные, см. рисунок 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали протокол эмбриона изоляции, которая является быстрым, эффективным, и может быть легко переведены в другие лаборатории.
Оборудование, описанное здесь состоит из инвертированного микроскопа, микроманипулятор, стекло микрокапиллярам, вертикальная нить…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Таль Nawy и Мартин Bayer за их советы на эмбрион изоляции. MTR В.Г., UG и ЦБ разработали оборудование эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ разработал протокол эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ установил протокол, изолированных зародышей и эмбрионов сгенерированный кДНК, В. Г. исполнил ПЦР, MTR окрашивания GUS, JJ FISH экспериментов. MTR В.Г., CG и UG написал рукописи. Эта работа финансировалась в университете Цюриха, в Братстве Roche Research Foundation (для MTR) и гранты от Швейцарского национального фонда (в UG и ЦБ).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
Referências
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
