Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento de Arabidopsis thaliana Sementes. Até 40 embriões podem ser isolados em 1 hora a 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. O procedimento é adequado para transcriptoma, a metilação do DNA, a expressão do gene repórter, imunomarcação e fluorescência In situ Análises de hibridização.
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Artigo de método
Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de
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Resumo
Resumo
Em plantas com flores, o embrião se desenvolve dentro de um tecido nutritivo - o endosperma - cercado pelos tegumentos de sementes maternas (ou tegumento). Como consequência, o isolamento de embriões de plantas em fases iniciais (1 célula para a fase globular) é tecnicamente difícil devido à sua relativa inacessibilidade. Dissecção Manual eficiente em fases iniciais é fortemente prejudicada devido ao pequeno tamanho dos jovens de sementes de Arabidopsis e a adesividade do embrião para os tecidos circundantes. Aqui, nós descrevemos um método que permite o isolamento eficiente de embriões jovens de Arabidopsis, originando até 40 embriões em 1 hora e 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. Os embriões são libertados no tampão de isolamento por esmagamento ligeiramente 250-750 sementes com um pilão de plástico num tubo Eppendorf. Um copo microcapilar ligado a qualquer uma pipeta padrão de laboratório (através de um tubo de borracha) ou de um microinjetor controlada hidraulicamente é usado para coletar embriões de lugar gotículasd numa lâmina de multi-poços em um microscópio óptico invertido. As competências técnicas necessárias são simples e facilmente transferível, ea configuração básica não requer equipamento caro. Os embriões recolhidos são apropriados para uma variedade de aplicações a jusante, tais como RT-PCR, o RNA de sequenciação, análise de metilação de ADN, hibridação in situ fluorescente (FISH), a imunocoloração, e ensaios de gene repórter.
Introdução
O embrião de plantas floridas está rodeado pelo endosperma, um tecido nutritivo derivado de um segundo evento de fertilização. Ambos embrião e endosperma está cercado por várias camadas de células do tegumento. Colectivamente estes tecidos formar uma semente, que se desenvolvem no interior do fruto. Assim, tecidos e análises específicas de células de embriões de Arabidopsis são fortemente prejudicada devido a sua inacessibilidade. No entanto, os embriões nas fases de fim de globulares ou mais tarde, são relativamente bem passível de dissecção manual utilizando agulhas finas de tungstênio sob o microscópio estereoscópico, ou com uma ligeira pressão sobre a se....
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Protocolo
O procedimento está resumido no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. O microcapilares e a configuração instrumentais são apresentados na Figura 2 e Figura 3, e os passos típicos de isolamento de embriões são mostrados na Figura 4.
1. Material e Preparação de buffer
1,1 Silício revestimento de vidro microcapilares
- Coloque a microcapilares em um tubo Falcon de 15 ml com ~ 5 ml de Sigmacote (Sigma) e gire várias vezes.
- Remover a solução, colocar um tubo Falcon contendo os capilares numa folha de alumínio e cozer durante 3 hor....
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Resultados
O processo de isolamento do embrião (Figura 1) permite o isolamento de até 40 embriões em 4 horas, se as lavagens são realizadas, por exemplo, para aplicações moleculares, ou em menos de uma hora, se as lavagens são omitidos, por exemplo, para aplicações citológicos. Figura 2 exibe alta e baixa dicas microcapilares qualidade e A Figura 3 mostra a configuração da máquina de isolamento do embrião. Figura 4 mostra o processo de isolamento.......
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Discussão
Foi desenvolvido um protocolo de isolamento do embrião, que é rápida, eficaz, e pode ser facilmente transferido para outros laboratórios.
O equipamento aqui descrito é composto por um microscópio invertido, um micromanipulador, vidro microcapilares, um puxador de filamento vertical e um microinjector (Figura 3A). A instalação é semelhante à descrita para o isolamento única célula animal para análises transcriptomics 17. Também trabalhou com sucesso com uma configu.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer Tal Nawy e Martin Bayer para os seus conselhos sobre o isolamento do embrião. MTR, VG, UG e CB inventou o equipamento de isolamento de embriões. MTR, VG e CB desenvolveu o protocolo de isolamento de embriões. MTR, VG e CB estabelecido o protocolo, isolado dos embriões, e embrião gerado cDNA, VG realizada a PCR, MTR a coloração GUS, JJ experimentos os peixes. MTR, VG, CG e UG escreveu o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Zurique, uma bolsa da Fundação Roche Research (a MTR), e doações da Fundação Nacional da Suíça (para UG e CB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contido no pacote Superscript II |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contido na embalagem Superscript II |
| Albumina de soro bovino (BSA) 100x = 10 mg / ml | New England Biolabs Inc. | Diferentes fornecedores também trabalharão | |
| Capilares de parede fina 1,0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tubo 0,5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5 poços 10 mm de diâmetro lâminas | Microscopia Eletrônica Ciências | 63421-10 | |
| Solução de Formaldeído | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Glä ser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glicina | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pilão | VWR | 431-0094 | |
| Seringas de insulina microfina | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Etanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Fórceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalisador Pico Chip Agilent | Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Microscópio invertido | Nikon TMS (Japão), | ||
| Micromanipulador | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Sonda pós-montagem LH1 | Leica microsystems | 39430101 | Marca diferente também fará o trabalho |
| Extrator de filamento vertical | Instrumento Sutter | modelo P-20 | Outro modelo também é adequado |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (tecnologias |
Referências
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell s....
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Reimpressões e permissões
