Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Resumo

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Resumo

Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis ​​pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 ^H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.

Introdução

A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes ^1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue ^2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por resultar em tanto a perda da capacidade de destruição de células β e secreção de insulina a partir de células individuais ^β-3. Compreender os mecanismos de células-β subjacentes a progressão da diabetes tipo 1 e 2, esperamos dar origem a novas terapias para prevenir e tratar estas doenças.

In vitro timodelos de cultura ssue, tais como o INS-1 e MIN6 linhas de células imortalizadas β, podem ser ferramentas úteis para a compreensão da função das células β específicos. No entanto, as interações entre os diferentes tipos de células dentro da ilhota-se pode regular a função das células β. Por exemplo, a influência parácrina de glucagon (libertado a partir de células-α) e somatostatina (libertado a partir de células-δ) em aumentar e diminuir a secreção de insulina, respectivamente, demonstra a importância da proximidade de células de células na resposta endócrina ^4. Além disso, junções entre as células-β potencializar a liberação de insulina ^5. Além disso, embora tenham sido feitos progressos na geração de linhas de insulinoma que melhor replicados a resposta fisiológica de ilhéus isolados de glicose (por exemplo, o INS-1 derivado de 832/13 e 832/3 linhas de células), a sua capacidade de resposta de glucose ainda difere do normal de rato ilhotas ^6,7. Além disso, a resposta destas linhas celulares de insulinoma clonaisa peptide-1 (GLP-1) agonistas de glucagon-like pode variar drasticamente de uma outra, bem como a partir de ilhéus normais ^6. Portanto, as linhas de células imortalizadas podem não representar o melhor modelo para os agentes de ensaio que o impacto sobre a produção de cAMP.

Em contraste com as linhas de células derivadas de insulinoma, estudar a função das células β exclusivamente em modelos animais completos oferece o seu próprio conjunto de complicações. Um dos maiores desafios no trabalho com tecido endócrino está medindo a concentração precisa de hormônio liberado. Especificamente, o fígado desempenha um papel importante metabolizar a insulina, e o fluxo de sangue pâncreas vai directamente para o fígado. Assim, uma medição de insulina no plasma podem não descrever com precisão a quantidade de insulina a ser segregadas a partir da própria pâncreas ou o impacto de diferentes tratamentos sobre a taxa de secreção de insulina ^8. Além disso, o metabolismo renal do glucagon pode limitar a confiabilidade da produção de glucagon a partir de células dos ilhéus ^α-9. Portanto, isolar ilhotas principal do mouse para a experimentação in vitro proporciona uma compreensão mais precisa de como a ilhota está respondendo a estímulos específicos para complementar as medições feitas in vivo.

O presente protocolo para o isolamento de ilhotas de rato é um protocolo bem estabelecido usado por um número de grupos (com pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso) ^10,11. Além disso, a determinação da produção de cAMP permite uma leitura directa da capacidade de resposta das células incretina-β. Em conjunção com a medição de cAMP, teor de proteína e a secreção de insulina pode também ser quantificada a partir da mesma preparação de amostras de cAMP, ajudando a determinar se um defeito na função das células-β reside proximal ou distal em AMPc ^10. O conteúdo cAMP final e aplicação da secreção de insulina neste protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa para a compreensão da influência de componentes farmacêuticos e dietéticos, entre outross, em cAMP e secreção de insulina. Além disso a estimulação da glucose sozinha, outros compostos podem ser utilizados para medir as alterações do cAMP e secreção de insulina ^10,11.

Finalmente, embora a insulina é a hormona primária que ensaiar a partir de ilhotas isoladas, outras hormonas, como o glucagon e somatostatina, assim como citoquinas, e eicosanóides, o monofosfato cíclico de adenosina, pode também ser medida, quer por um ensaio de estimulação transitória ou por quantificação de os seus níveis no meio de cultura ^12. Finalmente, embora fora do âmbito deste manuscrito, isolamento de ilhotas com o método de isolamento da colagenase descrita permite a preservação da ilhota de forma que muitas outras aplicações a jusante, pode ser exercida, tal como o transplante de ilhotas, para isolamento de RNA por PCR quantitativo em tempo real ou de microarray análises de proteínas isolamento por Western blot, dos ilhéus incorporação e imagiologia de imunofluorescência, e incorporação de [3H]-timidina como medida de repli antiilhotascação, alguns dos quais têm sido descritas em artigos anteriores JoVE ^13-16. No geral, seguindo o procedimento de isolamento das ilhotas descritos no protocolo pode fornecer um pesquisador com informações importantes e úteis para o desenvolvimento de terapias e promover a descoberta de medicamentos destinado a melhorar a função das células β.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC), da Universidade de Wisconsin-Madison.

1. Preparação de Soluções

1. O método de eutanásia neste protocolo é sangria sob anestesia Avertin (para uma revisão de alternativas, ver Discussão). Para fazer Avertin, adicionar 0,625 g (1,25% ou 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoetanol a 1,25 ml de 2-metil-2-butanol em um tubo de 15 ml e aquece-se a 37 ° C durante 20-30 min. Vortex a solução em alta por 10-15 segundos de cada vez para dissolver totalmente o 2-2-2 tribromoetanol. Depois de completamente dissolvido, adicione a solução de 48,75 ml de destilado duplo H ₂ O, filtrar através de um filtro de 0,45 em um novo tubo de 50 ml, 50 ml embrulhar as cônicastubo de al em folha de alumínio e armazenar a 4 ° C por até um mês. Traga o tubo para RT antes de injetar camundongos.
2. Para fazer Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS), certifique-se 1 L 1x HBSS a partir de um estoque de 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) em duplo H ₂ O destilada, adicionar 0,35 g (4,2 mM) Nacho ₃ e loja a 4 ° C durante até 1 mês. Para cada rato, 105 ml desta solução (mais 5-10 mL adicionais para a pipetagem de erro) será necessária para o isolamento dos ilhéus.
3. Ilhotas são muito suscetíveis a danos de hipóxia; portanto, faz-se borbulhar HBSS com 95% _de O2 / 5% de CO ₂ para imitar as concentrações de _O2 no sangue. Misturas de gases especiais podem ser comprados e uma estação de borbulhamento configurado com uma pipeta Pasteur anexado ao tubo flexível. Após borbulhar a quantidade necessária de HBSS com 95% _de O2 / 5% de CO ₂ durante 15 min, adicionar 0,02% de BSA de pureza RIA (albumina sérica bovina), em volume, e manter em gelo durante a remainder do isolamento de ilhotas.
4. Para a preparação de Ficoll, pesam-se 32,5 g de Ficoll em um copo de 400 ml, adicionar 80 ml de HBSS, e agitar a 500-700 rpm durante 30 min. Uma vez dissolvido, verter a solução Ficoll em um cilindro graduado de 250 ml e adicionar HBSS para a marca de 130 ml no cilindro graduado para criar uma solução de Ficoll a 25%. Cobrir a parte superior do cilindro graduado com duas porções de Parafilm ® M (Pechiney Embalagens plásticas Company, Chicago, IL) e agitar vigorosamente várias vezes.
5. Para uma solução de Ficoll 23%, 20,5%, e 11%, adicionar 27,6, 24,6, e 13,2 ml de 25% de Ficoll, respectivamente, para 50 ml de tubos cónicos. Então, trazer cada solução até um total de 30 ml com HBSS e agite bem para misturar. Todas as quatro soluções de Ficoll deve ser armazenada a 4 ° C e são boas durante até 2 semanas.
6. Solução de colagenase que é adequado para o isolamento de ilhotas activas é preparado a partir de colagenase isolada a partir de Clostridium histolíticaum (a tabela de materiais). Cada lote tem de ser testado para a eficiência da enzima. Tipicamente, a colagenase é usado em 0,3-0,5 mg por ml de HBSS. Utilizando concentrações de enzima em que a faixa (normalmente 3 concentrações diferentes), determinar a qualidade e quantidade de ilhéus isolados de ratinhos da mesma ninhada ou para definir a concentração da enzima de trabalho com a mesma idade.
7. Uma vez que a concentração correcta é determinada, cada rato requer 35 ml de colagenase em HBSS durante todo o protocolo de isolamento. Agitar a colagenase em HBSS para dissolver. Imediatamente antes da cirurgia, pré-carregar uma seringa de 5 ml com solução de colagenase, colocar a cânula e remover as bolhas de ar, e deixar em gelo até ser necessária.
8. Os meios de cultura ilhotas de O / N a incubação é um RPMI suplementado 1640. Para a solução estoque, dissolver um pacote de RPMI 1640 (Gibco, New York) em 1 L de dupla _H2O destilada e adicionar 1,19 g de HEPES (5 mM) e 2 g de Nacho ₃ (24 mM). Ajustar o pH para 7,4,Esterilizar por filtração, e armazenar a 4 ° C no escuro.
9. Para os meios suplementados, adicionar 10% de FBS e 100 UI/100 mg / ml de penicilina / estreptomicina, respectivamente, para as ações RPMI 1640. Se uma concentração de glucose é diferente desejado, livre de glucose no meio RPMI 1640 pode ser usado e pode ser adicionado uma concentração específica de glicose.
10. Para um estoque Krebs Ringer bicarbonato Buffer (Krebs), adicione os seguintes ingredientes para dobrar água destilada nas seguintes concentrações: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO ₄ (1,18 mM), KH ₂ PO ₄ (1,18 mM ), nacho ₃ (25 mM), HEPES (5 mM), e _CaCl2 (2,52 mM) a pH 7,4. CaCl ₂ deve ser adicionado em último lugar e esta solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 2 semanas.
11. Para fazer um estoque de trabalho de Krebs, primeiro gás com 95% de O _2/182 5% de CO ₂ durante 10-15 minutos com uma pipeta de Pasteur, a 37 ° C, seguido pela adição de 0,5% de BSA de grau RIAem volume. Em seguida, a adição de glicose para a concentração desejada para o ensaio in vitro.

2. Preparação de Ferramentas

1. Ligeiramente neutralizar as pontas de 30 - e 27-G agulhas usando uma pedra de amolar para arredondar a ponta afiada. Coloque uma curva de 45 graus na agulha cerca de ¼ de polegada da ponta usando um par de alicates. Ter cuidado de não apertar demasiado rígido, o que vai fechar o diâmetro interno da agulha.
2. Cortar o fio 3/0 de seda de sutura em comprimentos de aproximadamente 4 polegadas, um para cada rato.
3. Cubra a base do microscópio de dissecação com filme plástico e fita para baixo.
4. Corte vários pedaços de papel absorvente banco, cerca de 3 x 5 polegadas de tamanho, por pelo menos 2 por mouse.

3. Preparando o mouse

1. Encher uma seringa de 1 ml com 1 ml de Avertin.
2. Injectar a solução avertina intraperitonealmente em cerca de 40 ul / g de peso corporal.
3. Após o mouse não longer responde a cauda ou pitadas das patas traseiras, transfira-o com cuidado para a estação de trabalho de dissecação microscópio.
4. Com o mouse na posição supina e sua cabeça virada para distal, pulverizar o mouse com 70% de etanol aquoso. Certifique-se de usar uma quantidade adequada de 70% de etanol para limitar a quantidade de pele na cavidade torácica exposta.

4. Abrindo a cavidade torácica

1. Aperte a pele e pele do rato entre as duas patas traseiras e faça um corte inicial através da epiderme, derme e da membrana subjacente.
2. Enquanto ainda beliscar a pele e membrana subjacente, cortou para o membro da frente em ambos os lados do rato tendo o cuidado de evitar o corte quaisquer órgãos internos.
3. Dobre a aba de pele e membrana sobre a caixa torácica e remover o apêndice xifóide para permitir um acesso mais fácil ao pâncreas para a inflação.
4. Reorientar o mouse com a cabeça virada para proximal e movimentar os órgãos internos em direção ao lado direito do trabalho ruação para revelar a aorta descendente.
5. A não ser que o tecido de sangue deve ser recolhido, a aorta descendente, podem ser cortadas para completar a eutanásia. Banhe-se ao excesso de sangue com papel de banco ou uma Kimwipe para facilitar o acesso do ducto biliar comum.

5. Inflar o Pâncreas

1. Com um microscópio de dissecação, reposicione o intestino delgado para que o ducto biliar comum forma uma linha perpendicular com a cabeça do rato.
2. Tome uma pinça e agarrar o intestino delgado e encontrar o esfíncter de Oddi (esfíncter de ampola) no final do ducto biliar comum, que splays-se para o intestino delgado do ducto biliar, formando um triângulo branco no intestino rosa. Uma vez que o esfíncter de Oddi foi localizado, levar # 5 fórceps Dumont e deslize a ponta debaixo do ducto biliar comum mais próximo possível do intestino delgado quanto possível, tomando cuidado para não furar o duto.
3. Após a perfuração através do intestino delgado e do tecido conjuntivo, utilizar oponta da pinça Dumont para compreender a sutura e puxe-o sob o ducto biliar comum. Empate fora do ducto biliar comum mais próximo possível do esfíncter de Oddi possível, certificando-se o nó é esticada para evitar fugas.
4. Segure as duas extremidades da sutura e puxe para a cauda para colocar um pouco de tensão no ducto biliar comum. Usando uma mão livre, fazer uma pequena incisão com as micro tesoura no ducto biliar comum logo acima da última bifurcação para o fígado. Nota: É importante não cortar demasiado perto do esfíncter de Oddi, pois isso pode resultar em uma inflação parcial do pâncreas e evitar o corte através do ducto biliar comum, como também irá resultar em uma inflação baixa.
5. Enquanto segura as duas extremidades da corda com o ducto biliar comum tenso, retire a seringa / cânula que tenha sido pré-carregado com 5 ml de solução de colagenase o balde de gelo, colocou a seringa e insira a agulha embotada 30 G no corte ducto biliar comum, não tendo o cuidado de furar o através do wall do duto. Se a agulha 30 G não é grande o suficiente para o ducto biliar para formar uma vedação em volta, removê-lo e substituir com o embotado 27 G agulha.
6. Enquanto segura a agulha no lugar, solte a sutura e pegar a seringa de 5 ml. Lentamente, o êmbolo da seringa. Nota: Se a agulha foi inserida com sucesso no ducto biliar comum, ele irá se expandir.
7. Continue a pressionar o êmbolo devagar e deixar fora de uma maneira pulsátil até a primeira parte do pâncreas infla, seguido pela constante pressão suave até o pâncreas já não infla. Nota: A maioria pancreases segurar 3-5 ml antes de começar a vazar. Além disso, uma inflação de sucesso vai ter uma distribuição uniforme do tecido exócrino e a parte do pâncreas na parte superior do estômago será insuflada.
8. Retire a agulha do ducto biliar comum e partiu para o lado.

6. Remoção Pâncreas

1. Tome uma pinça em uma mão e uma tesoura curva emo outro. Usando a pinça, segure o intestino delgado no esfíncter de Oddi. Com a tesoura fechada, use a ponta de parte separada do pâncreas do intestino delgado.
2. Espalhar a tesoura para além de aumentar a distância entre o intestino delgado e o pâncreas.
3. Coloque o "V" das tesouras em que o intestino delgado e do pâncreas ligam um ao outro no lado direito do hiato que foi acabada. Usando a pinça puxe o intestino delgado passado a tesoura para remover o pâncreas.
4. Continue trabalhando para baixo do intestino delgado para o tecido conjuntivo rosa. Neste ponto, pegar o intestino delgado, perto de onde ele atribui ao estômago e cortar o pâncreas longe do resto do intestino delgado. Nota: Tenha cuidado para não cortar o pâncreas, pois pode começar a desinflar.
5. Gentilmente pegar a parte do pâncreas ligados ao estômago com uma pinça (fórceps lisos funcionam melhor). Enquanto puxa-se delicadamente sobre o pâncreas, use a curvad tesoura para cortar fora as conexões entre o pâncreas eo estômago.
6. Localize o baço e segure-o com a pinça acima do pâncreas. Tome as tesoura curva e cortar as conexões entre o baço eo pâncreas.
7. Encontrar onde o pâncreas está ligado ao intestino grosso. Pegue o intestino grosso com uma pinça e use a ponta da tesoura para picar completamente. Espalhar a tesoura distante como antes para gerar um hiato entre o intestino grosso e pâncreas.
8. Realizar-se o intestino grosso com uma pinça: isto resultará no pâncreas afastamento, expondo as suas ligações precisas para o intestino grosso. Cortar fora as ligações restantes.
9. Encontre o tecido conjuntivo rosa ligado ao pâncreas e intestino delgado e cortar o mais próximo possível do pâncreas quanto possível. Nota: Se a perfuração do pâncreas é uma preocupação, é aconselhável cortar mais perto do intestino delgado como o tecido conjuntivo, serão filtrados em etapas posteriores.
10. Grab tanto do pâncreas possível e levante-o suavemente. Com uma tesoura curva, cortar as conexões restantes entre o pâncreas e na cavidade torácica para remover completamente o pâncreas. Nota: O pâncreas ainda deve ser inflado se for removido corretamente.
11. Armazenar o pâncreas removido em ~ 2,5 ml de solução de colagenase em um tubo de 50 ml em gelo, até todos os outros os pâncreas foram removidos e inflados pela experiência.

7. Lavar

1. Toma todos os pâncreas isolados e movê-los para separar 50 ml de tubos cónicos cada um contendo 25 ml de solução de colagenase fresco
2. Coloque os 50 ml tubos cônicos de pé em um 37 ° C tremendo banho de água capaz de oscilar em 220-250 rpm, com o agitador desligado.
3. Gás de cada tubo de 50 ml com 95% _de O2 / 5% de CO ₂ durante 5 min com uma pipeta de Pasteur.
4. Recapitular cada tubo bem e coloque de lado na água agitandobanho por baixo da superfície da água. Agitar a 220-250 rpm durante 20 segundos, a cada dois minutos, até aos 16 min a partir de 6 min. (Agitar a 6, 8, 10, 12, 14, e 16 min)
5. Transferir imediatamente os tubos a uma centrifugação a temperatura ambiente durante uma rotação rápida. Traga a centrífuga até 1.500 rpm (400-500 g) e desligue imediatamente.
6. Utilizando uma armadilha de vácuo, aspirado de cerca de 22,5 ml da solução de colagenase sem perturbar o sedimento. Lava-se com 10 ml de HBSS e vortex suavemente para romper a pelota.
7. Executar outra volta rápida à temperatura ambiente até 1.500 rpm (400-500 g).
8. Aspirar a cerca de 10 ml da solução, novamente, sem perturbar o sedimento.
9. Lavar com mais 10 ml de gelo frio HBSS e vortex suavemente para mais uma vez acabar com a pelota. Repita os de spin e aspirado rápidas 10 ml da solução.
10. Suavemente vortex a pelota nos restantes 2,5 ml de solução de HBSS. Despeje solução atravésde 1.000 mM de malha para um novo tubo de 50 ml. Isto removerá o grande restos de tecido não digerido pela colagenase.
11. Lavar o velho tubo de 50 ml com 2,5 ml de HBSS gelado. Usar uma pipeta de Pasteur, para lavar as paredes do tubo completamente antes de transferir a 2,5 ml de HBSS através da malha para as novas tubo de 50 ml.
12. Executar outra volta rápida à temperatura ambiente a 1.500 rpm (400-500 g) para sedimentar o tecido.
13. Aspirar todo o HBSS pela inclinação do tubo para a armadilha de vácuo. Nota: É muito importante para não perturbar o sedimento, pois isso resulta na perda de ilhotas. Se o pellet é solto ou começa a se mover em direção à armadilha de vácuo, pare de aspiração da solução e re-agregar o tecido e, em seguida, continuar a aspirar a solução restante.
14. Uma vez que todo o HBSS foi removida, adicionar 4,8 ml de solução de Ficoll a 25% e de vórtice para quebrar o grânulo.
15. Camada cuidadosamente 2,4 ml de 2Solução de Ficoll 3% em cima da solução Ficoll 25% por adição da solução de 23% de Ficoll para o lado do tubo de 50 ml. Para garantir ainda camadas, gire o tubo cônico de 50 ml, ao adicionar a solução de Ficoll.
16. Repita o processo de separação para 20,5% e, em seguida, soluções Ficoll 11%. Nota: Se quatro camadas distintas não estão presentes, adicione HBSS até a marca de 50 ml e inverter o tubo 4-6 vezes ou até que o gradiente de Ficoll não existe mais. Re-agregar o tecido e repita os passos 7,14-7,16.
17. Girar o tubo cónico de 50 ml, a RT a 1,820 rpm (800 g) durante 15 min.
18. Despeje todo o Ficoll em um tubo de 50 ml fresco, tendo o cuidado de deixar o sedimento do tecido exócrino atrás. Adicione gelo HBSS frio até a marca de 50 ml e inverter o tubo 4-6 vezes para misturar o Ficoll e HBSS juntos.
19. Girar o tubo cónico de 50 ml, a RT a 1,820 rpm (800 g) durante 5 min.
20. Aspirar cuidadosamente a maior parte da mistura HBSS / Ficoll usando um tra vácuop. Não perturbe a pelota como ele está solto e pode ser aspirado facilmente.
21. Dê uma pipeta Pasteur e transferir a pelota para um tubo de cultura descartável.

8. Escolher Ilhotas

1. Adicionar 5 ml de mídia Picking (ie. Complementada RPMI 1640 ou Krebs Ringer bicarbonato buffer) para o tubo de cultura descartável. Nota: Os meios de comunicação escolhem irá variar dependendo da aplicação a jusante.
2. Deixe as ilhotas assentar no fundo do tubo de cultura para 5 min. Transfira-os com uma pipeta de Pasteur a uma 15 milímetros por 60 milímetros de poliestireno placa de Petri. Nota: É importante a utilização de uma placa de Petri como estes não são tratadas e vai impedir que os ilhéus de aderir ao prato.
3. Em separado 15 milímetros por 60 milímetros de poliestireno placa de Petri, adicionar 5 ml de rato meios de cultura ilhéu (100 ml RPMI 1640 Banco de Mídia, 10 ml inactivado pelo calor FBS, 1 ml Pen / Strep, filtro esterilizado).
4. Com o auxílio de um microscópio de dissecação com backligcapacidade ht, use uma pipeta P-20 para escolher as ilhotas na placa de Petri contendo meio de cultura ilhéu, tendo o cuidado de evitar a transferência de restos de tecido acinar. Quando iluminado, ilhotas aparecerá marrom-dourado e sua membrana externa pode brilhar, enquanto o tecido acinar aparecerá cinza claro e sem brilho. Se a preparação ilhota contém uma grande quantidade de detritos, é aconselhável escolher a mão-ilhotas duas vezes em meio fresco. Reduzir a contaminação de detritos irá limitar ilhota aglutinação após uma incubação durante a noite. A adição de DNAse (3000 U / ml) ao tampão de digestão pode também contribuir para limitar a acumulação de ilhotas (JWJ, observação pessoal). Nota: É importante contar o número de ilhotas isoladas para planejar experimentos a jusante.
5. Incubar a ilhotas S / N numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO _2.

9. Ensaio cAMP

1. Rotular tubos de microcentrífuga de 1,7 ml, um para cada repetição do ensaio. Nota: Os ensaios acampamento deve ter, pelo menos duSão preferidos plicates para cada condição de tratamento, mas mais repetições por tratamento.
2. Após a formação de gás de Krebs Ringer Tampão bicarbonato durante 15 minutos com 95% _O2 / 5% de CO _2, com a pipeta de Pasteur, adicionar 0,5% de BSA de grau RIA e uma concentração final de 1,7 mM de glucose (solução de pré-incubação). Em seguida, adicione 1 ml de Krebs recém gaseados a cada tubo de microcentrífuga. Dois ml de Krebs é necessária por tubo para a pré-incubação e tempo de tratamento de pontos; No entanto, recomenda-se preparar pelo menos 5-10 ml extra.
3. Agitar as ilhotas para o meio da placa de Petri, e usando uma pipeta P-20, mão-escolher as ilhotas para um novo 15 milímetros por 60 milímetros de poliestireno placa de Petri contendo 5 ml da solução de pré-incubação a lavar o meio de cultura contendo glucose a partir das ilhotas.
4. O kit de ensaio cAMP utilizada é a GE Healthcare cAMP direto BioTrak EIA. O prococol utilizado é uma modificação do descrito por "medição de cAMP intracelularesurement usando o procedimento de AIA não acetilação com os novos reagentes de lise ", e foi optimizado para utilização com o número mínimo de ilhotas por tubo, permitindo a um número aumentado de condições de tratamento e as repetições técnicas. Usando um P-20 pipeta, tomar pelo menos 13 ilhotas em cada tubo do passo 9.2, mantendo o tamanho das ilhotas consistência entre os tubos, com 1 ml de tampão de pré-incubação. Nota: O aumento do número de repetições é mais benéfico do que o número de ilhotas por tubo. No entanto, se houver ilhotas suficientes para aumentar o número de ilhotas por tubo uniformemente, é aconselhável a fazê-lo, até 25-50 ilhotas por tubo.
5. Com as tampas de tubos de microcentrífuga aberta, a transferência para uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO ₂ e incubar durante 45 min para normalizar a secreção de insulina de ilhotas todos a um nível de linha de base.
6. Enquanto as amostras são incubação, preparar os tratamentos (ou seja, 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM de glicose, etc) no fr Krebs gaseadosom o passo 9.2. em tubos de 15 ml cônico, com 1 ml extras para dar conta de qualquer erro de pipetagem. Adiciona-se 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) para uma concentração final de 200 uM. IBMX é um inibidor geral da fosfodiesterase que bloqueia a degradação de AMPc, o que permite a acumulação de cAMP na célula, uma vez que é produzida. (Nota:.. Este é um ensaio de produção de AMPc verdade Consulte a seção de discussão para casos em que a medição da produção de AMPc pode não ser desejável Se IBMX é deixado de fora do ensaio, mais ilhotas será exigido por tubo, a fim de obter dados acampamento no intervalo linear da curva padrão).
7. Após os 45 min de pré-incubação, remover os tubos de microcentrífuga da incubadora, o tampão e pulso-vórtice cada amostra (a menos de 0,5 seg). Este é misturar-se o gradiente de insulina que tenha sido provavelmente gerado devido às ilhotas sendo concentradas no fundo do tubo. Cuidados devem ser tomados para não vortex duro demais, pois isso pode afetar negativamente a estabilidade das ilhotas (Nota: Cobertatubos com ilhotas podem ser gentilmente jogou ou invertida, se não for possível a pulsar-vortex suavemente. Estas opções vão aumentar o tempo do ensaio, que deve ser considerado quando do planejamento do experimento).
8. Transfira cada tubo para centrífuga de bancada (RT) e girar até as ilhotas atingir 10.000 rpm (7,000-7500 g) e em seguida, desligue imediatamente.
9. Usar uma pipeta P-1000 para remover a maior parte do Krebs em cada tubo de microcentrífuga, deixando cerca de 10-15 uL de Krebs no sedimento ilhota. Usar uma pipeta P-20 para remover a porção mais próxima do sedimento da ilhota. Se pelete é perturbado, pipetar o Krebs volta para dentro do tubo e re-centrifugação.
   (Nota: Se o experimentador acha muito difícil remover todo o Krebs do sedimento ilhota sem perturbá-la, o último 10-15 mL pode ser deixado ligado e contabilizadas no volume total no final do protocolo.
10. Obter uma quantidade adequada de azoto líquido num recipiente isolado para encaixar congelar as amostras, após incubação.
11. Tome as amostras fora da incubadora, boné, vórtice rapidamente (menos de 0,5 seg) girar os tubos de microcentrífuga em uma centrífuga de topo de mesa (RT) até 10.000 rpm (7,000-7500 g), e depois desligar imediatamente. Se a insulina ou de outro metabolito é uma aplicação a jusante desejado, utilizar uma pipeta P-1000 para recolher uma alíquota do meio de um tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C até análise posterior. Se a mídia estimulação não estão sendo coletados, pode ser descartada.
    (Nota: IBMX é um forte potenciador da secreção de insulina estimulada por glucose (GSIS) Portanto, os resultados obtidos a partir de GSIS meio de estimulação de AMPc não pode representar exactamente o verdadeiro efeito de tratamentos específicos no GSIS, especialmente se estes efeitos são subtis.).
12. Repetir o passo 9.9 para remover meio de estimulação de, tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento ilhota. Encaixar congelar o pellet ilhota em nitrogênio líquido uma vez que há menos de 10-15 mL de Krebs esquerda na pelota ilhota. Uma vez que toda aAs amostras foram congeladas rapidamente, armazenar a -80 ° C até à medição de cAMP.
13. No dia da determinação de cAMP, preparar os novos reagentes de lise de acordo com o protocolo dos fabricantes. Adicione 200 ml de reagente de lise 1B para cada tubo de microcentrífuga e vórtice em alta velocidade por 30 segundos. Deixe os tubos de sentar em gelo durante 10 min, centrifugando a cada 2 min durante 30 seg. (Nota: O protocolo recomenda a realização de uma análise microscópica com azul de tripano para assegurar a lise das células, mas isto não é realizada por ilhotas).
14. Prepare os padrões de trabalho e configurar a microplaca EIA exatamente como descrito no protocolo do fabricante. Após o substrato da enzima foi incubada com a microplaca durante 30 min, executar o passo de 1,0 M de ácido sulfúrico opcional, e determinar-se a absorvância dos poços a 450 nm usando um leitor de microplacas.
15. Resultados AMP cíclico será registrado como fmol / poço. Isto deve ser normalizada para o volume total da amostra original (200 ul + nenhumaKrebs residual deixada sobre os ilhéus do passo 9.9). Em seguida, os resultados podem ser normalizados para o número total de ilhéus, dando fmol AMPc produzido / ilhota, ou amostras de lisado pode ser submetido a ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de proteína para normalizar os resultados de proteína celular total (dando proteína fmol / ug) . O último é recomendado quando os tamanhos das ilhotas são incompatíveis entre as amostras, e pode ser um substituto para o tamanho da ilhota. O kit de ensaio de proteína Pierce BCA tem sido usada com sucesso neste protocolo, e requer apenas 25 ml de amostra. Os padrões de BSA deve ser preparada no reagente de lise 1B a partir do kit de ensaio de cAMP.

Resultados

Para garantir um alto rendimento ilhota durante o isolamento, as técnicas cirúrgicas descritas no protocolo deve ser seguido de perto. Embora as técnicas apresentadas aqui vai ser adaptado para cada laboratório, existem alguns passos críticos que levarão a um isolamento bem sucedido. A fim de tornar o canal biliar comum de fácil acesso, recomenda-se que os órgãos de ser deslocado para o lado direito do rato (Figura 1). Além disso, isto irá permitir que o pâncreas são accionados com uma quantidade menor ...

Discussão

Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes ^18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações ^11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais como cAMP, pode...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase de Clostridium histolyticum adequada para isolar ilhotas ativas	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Solução salina balanceada 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (pó)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Fio de Sutura de Seda	Ferramentas Fine Science	18020-30
Dumont #5 Pinça	Fine Science Tools	11251-10
Pinça de 0,8 mm	Ferramentas de Ciência Fina	11050-10
Tesoura Curvada	Ferramentas de Ciência Fina	14061-10
Vannas-Tü bingen Tesoura de Mola - Reta/Afiada/8,5 cm/5 mm Ponta	Ferramentas de Ciência Fina	15003-08
Tesoura de Dissecção	Ferramentas de Ciência Fina	14002-14
ml BD Seringa Luer-Lok	BD	309646
Seringa BD de 1 ml	BD	309628
30 G BD Agulha 1/2" Comprimento	BD	305106
27 G BD Agulha 1/2" Comprimento	BD	305109
Pedra de Afiar	Ferramentas de Belas Costuras	29008-01
2-2-2-tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Cloreto de Sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Cloreto de Potássio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato monopotássico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Bicarbonato de sódio (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Soro Bovino Fetal Inativado por Calor (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG