Radikal-baserte biomimetic kjemi har blitt brukt til oppbygging biblioteker som er nødvendig for utvikling av biomarkører.
Involvering av frie radikaler i biovitenskap har stadig økt med tiden og har blitt koblet til flere fysiologiske og patologiske prosesser. Dette emnet omfatter ulike fagområder som spenner fra fysiske, biologiske og bioorganic kjemi til biologi og medisin, med søknader til forbedring av livskvalitet, helse og aldring. Tverrfaglig kompetanse er nødvendig for full undersøkelse av de mange fasetter av radikale prosesser i den biologiske miljøet og kjemisk kunnskap spiller en avgjørende rolle i avdukingen grunnleggende prosesser og mekanismer. Vi utviklet en kjemisk biologi tilnærming kunne koble frie radikaler kjemisk reaktivitet med biologiske prosesser, og gir informasjon om de mekanistiske trasé og produkter. Kjernen i denne tilnærmingen er utformingen av biomimetic modeller for å studere biomolecule atferd (lipider, nukleinsyrer og proteiner) i vandige systemer, skaffe innsikt i reaksjonsveier samt ens oppbygging molekylære bibliotek av den frie radikale reaksjonsprodukter. Denne sammenheng kan med hell brukes til biomarkører og eksempler er gitt med to klasser av forbindelser: mono-trans isomerer av kolesteryl estere, som er syntetisert og brukt som referanser for påvisning i humant plasma, og purin 5 ',8-cyclo-2 '-deoxyribonucleosides, forberedes og brukes som referanse i protokollen for påvisning av slike lesjoner i DNA-prøver, etter ioniserende stråling eller hentes fra ulike helsemessige forhold.
Reaktiviteten av frie radikaler avslørte sin enorme betydning for mange biologiske hendelser, inkludert aldring og betennelser. I dag er det mer og mer tydelig at avklaring av hvert kjemisk trinn er involvert i denne reaktivitet er nødvendig, for å forstå de underliggende mekanismene og ser for effektive strategier for kontroll av frie radikaler og reparasjon av skaden. Bidraget fra kjemiske studier er grunnleggende, men den direkte studie i det biologiske miljøet kan være vanskelig, siden overlagring av ulike prosesser kompliserer og perturbs undersøkelse av resultatene og de relaterte konklusjoner. Derfor har strategien modellering frie radikaler reaksjoner i henhold biologisk relaterte forholdene blir et grunnleggende skritt i forskningen av kjemiske mekanismene i biologi.
I det siste tiåret vår gruppe utviklet modeller av frie radikaler prosesser under biomimetic forhold. Spesielt no vivisaged biologisk relevante transformasjoner av umettede fettsyrer, nucleosides, og svovelholdige aminosyrer og sette dem i sporet til å bli vurdert og godkjent som biomarkører for helsestatus. 1-4
Vårt generelle tilnærming består av tre moduler:
Vi valgte to klasser av relevante biomarkører for å akkreditere denne tilnærmingen: kolesteryl estere og purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides.
Omdannelsen av naturlig forekommende cis umettede fettsyrer til geometrisk transisomerene er en transformasjon forbundet med produksjon av radikale stress i det biologiske miljøet. Cell membranlipider, som inneholder fettsyrer, er en relevant biologisk mål for radikal stress og studerte vi først den endogene cis-trans fosfolipider isomerisering i cellekulturer, dyr og mennesker som vurderer analytiske protokoller i hvert tilfelle. 8-10 Vi demonstrerte at denne transformasjonen kan oppstå ved en rekke S-holdige forbindelser, inkludert tioler, tioetere og disulfides, som under forskjellige radikale stressbetingelser er i stand til å generere thiyl radikaler, dvs. isomerisering agent (Figur 3). Eksempelet vist i denne artikkelen fokuserer på klassen av kolesteryl estere, som representerer en velkjent fraksjon av plasma lipider, strengt involvert i lipoprotein metabolismen. Ester kobling mellom fettsyrer og cholesterol er biosynthesized ved overføring av fettsyrer fra stillingen 2 av glyserol moiety av fosfatidylcholin til kolesterol, et skritt katalysert av enzymet lecitin kolesterol acyl transferase (LCAT). Derfor er plasma kolesteryl estere strengt forbundet med membran lipid omsetning, og inneholder relativt høye andeler av de flerumettede fettsyrer (PUFA) som typisk er tilstede i fosfatidylcholiner, dvs. linolsyre og arachidonic syrer. Lipoprotein formasjonen er involvert i hjerte-og metabolske sykdommer. Reaktiviteten av naturlige kolesteryl estere med frie radikaler kan oppstå på dobbeltbindinger av linoleat og arachidonate rester, som kan omdannes i den tilsvarende trans geometriske isomere (se Figur 1 for strukturer). Karakterisering av den trans kolesteryl esterinnhold i biologiske prøver er interessant for utvikling av biomarkører. En indirekte metodikk består av transformasjonen av cholesteryl estere isolert fra plasma til de tilsvarende fettsyremetylestere (FAME) og separasjon ved gasskromatografisk protokoller. I dette tilfellet, er kalibreringen av standard referanser av cis-og trans-fettsyremetylestere utført, for å tillate kvantitering av trans innholdet i prøvene. Basert på de analytiske studier utført på kolesteryl ester biblioteket foreslo vi å anvende også en metode basert på Raman spektroskopi, som kan utføres direkte på kolesteryl ester fraksjonen isolert fra plasma, uten ytterligere derivatisering til tilsvarende FAME (se figurene 2 og 9). Det er verdt å merke seg at inntil nå ingen vellykkede metoder er beskrevet for å skille cis-og trans-isomerene av fettsyrer som inneholder lipider ved HPLC, som i stedet beskrevet av kolesteryl ester hydroperoksider. Så langt er den indirekte gasskromatografisk metode fortsatt den beste tilgjengelige metoden så langt. Ved denne metoden første kvantitative evaluasjon av de mono-trans innhold avledet fra kolesteryl estere isolert fra plasma av friske personer ble levert. Bruke Flame Ionisering Detector (FID) grensen for oppdagbarheten tilfredsstillende (ppb) og nanomolare mengder av forbindelsene er blitt påvist. 5. Med ulike sporingssystemer denne grensen kan bli enda lavere. Effekten av ioniserende stråling på kolesteryl estere er spørsmål videre studier, enten en lineær respons oppnås i forhold til den påførte dose.
Som et annet eksempel, valgte vi modifiserte nukleosider som kan produseres av fri radikal skade av DNA. Hydroksylradikaler (HO •) er kjent for å være de mest skadelige reaktive oksygen arter (ROS) for deres evne til å forårsake kjemiske modifikasjoner til DNA. Én eller flere lesjoner kan oppstå på DNA, som i eukaryote celler er plassert i kjernen, og mitokondrier. Identifisering og måling av de viktigste klasser av oksidative genererte skader DNA krever approprIate molekylære bibliotek for å sette opp den analytiske protokoller. Vi fokuserte vår interesse på de minste tandem lesjoner, som er purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, har en ekstra kovalent binding mellom basen og sukker enheter skapt av frie radikaler angrep. Forbindelsene er 5 ',8-cyclo-2'-deoksyadenosin og 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine eksisterende i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). Deres potensial til å bli friradikal stresset markør er spørsmål grunnleggende forskning. 2 Faktisk, når DNA utsettes for HO • radikal hydrogen abstraksjon fra C5 'posisjon av sukkeret er en av de mulige hendelser som fører til dannelsen av disse tandem lesjoner. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kan måles som sum av diastereomerer etter HPLC-MS/MS i enzymatisk fordøyd γ-bestrålte DNA-prøver varierende 1-12 lesjoner / 10 6 nukleosider / Gy går formen fravær av oksygen til fysiologisk nivå av oksygen jegn vev, det diastereomere ratio 5'R / 5'S blir ~ 4 og ~ 3 for 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo, henholdsvis (Figur 11). 11. Det er verdt å merke seg at forholdet mellom stråledose og 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdAdo lesjoner oppdaget i mobilnettet DNA er langt fra å bli forstått. Den enkelt eksperiment basert på 2kGy bestråling rapportert i den eksperimentelle kan ikke betraktes avgjørende. 11 Videre forsøk av denne type og analytisk kvantifisering av fire lesjoner er nødvendig for å definere slik forholdet. Detekteringen av disse lesjonene og de mer populære oksidative transformasjoner (eksempel 8-okso-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) er noen intense undersøkelser, beviser viktigheten av både lesjoner under oksidativ metabolisme. 6,13 Bruken av HPLC -MS/MS (trippel kvadrupol) har en deteksjonsgrense nær 30fmol for alle fire lesjoner. Siste forbedringer hevdet å nå deteksjonsgrenser av attomol nivåer av instrumentet proCER. Basert på den aller siste litteraturen, 6 analytiske prosedyrer må inkludere riktig opprydding av prøven og berikelse for å møte påvisningsgrensene for MS / MS / MS (ion felle) eller MS / MS (trippel kvadrupol) brukt i vårt tilfelle.
Bio-inspirerte syntetiske prosedyrer av forbindelser 1-4 ble utviklet fra 8-bromopurine derivater under eller Fotolyse. 7,12 Disse prosedyrene innebære en radikal kaskade reaksjon som etterligner DNA skade mekanismen for dannelse av 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo lesjoner. Fra biologiske perspektiver, ble det funnet at disse lesjoner akkumuleres med aldring i en vev-spesifikk måte (lever> nyre> hjernen), som gir bevis for at DNA-reparasjon mekanismer er utilstrekkelig for å bevare det genetiske materialet fra disse lesjoner. 13 Ja, nukleotid excision reparasjon (NER) er den eneste veien for tiden identifisert for reparasjon av disse lesjonene. 2
De to klassees av forbindelser vist i figurene 1 og 5 er ikke kommersielt tilgjengelig i øyeblikket, men ved de syntetiske strategier er beskrevet i litteraturen ikke at det ville være vanskelig å forberede disse forbindelsene for kommersiell bruk.
Den tverrfaglige tilnærmingen gitt av kjemiske biologi studier ikke bare har en enorm verdi i identifisering av nye mekanismer som forekommer i det biologiske miljøet, men også gir en grunnleggende bidrag til biomarkører og diagnostikk, til slutt bringe nyheten i helsevesenet og forebyggingsstrategier. 14. kjemisk bidrag er nødvendig for en vellykket utvikling av molekylær medisin, skape integrerte plattformer og paneler for metabolsk profilering som forventes å gi en optimal rasjonalisering av intervensjon design, enten terapeutisk og ernæringsmessige, redusere usikkerhet og feil når de kan være forutsigbare.
The authors have nothing to disclose.
Finansiell støtte fra Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (UTSKREVNE-2009K3RH7N_002) og Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555) samt sponsing av COST CM0603 på "frie radikaler i Chemical Biology og Cost Action CM1201 på "biomimetic Radical kjemi" er takknemlig anerkjent.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |