Detta protokoll beskriver en experimentell metod för genomförande Fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) för att räkna mRNA i enskilda celler vid enda molekyl upplösning.
Den Fluorescens in situ hybridisering (FISH)-metoden gör att man kan detektera nukleinsyror i den nativa cellulära miljön. Här ger vi ett protokoll för att använda FISH att kvantifiera antalet mRNA i enskilda jästceller. Celler kan odlas i alla förhållanden av intresse och därefter fixeras och göras genomsläppliga. Därefter sänds flera enkelsträngade deoxioligonukleotider konjugerade till fluorescerande färgämnen används för att märka och visualisera mRNA. Diffraktionsbegränsad fluorescens från enstaka mRNA-molekyler kvantifieras med användning av en fläck-upptäckt algoritm för att identifiera och räkna antalet mRNA per cell. Medan mer standard kvantifiering metoder för Northern-blottar, RT-PCR-och gen microarrays uttryck ger information om genomsnittliga mRNA i bulkpopulation, underlättar FISH både räkningen och lokalisering av dessa mRNA i enstaka celler vid enda molekyl upplösning.
Använda bulk mättekniker, är det inte möjligt att analysera antalet transkript eller transkriptionell aktivitet inom enskilda celler 1. Använda fluorescerande proteiner som drivs av initiativtagarna intresse av uppgiftslämnare i genuttryck kan ta upp denna fråga i viss mån, men den tid som krävs för fluorescerande proteiner att vika döljer tidiga dynamik. Långlivade fluorescerande proteiner kan inte heller rapportera mRNA livslängd. FISH metoden kan användas för att analysera mRNA under dess livscykel, från transkriptionsinitiering i kärnan för efterföljande mognad och förfall i enstaka celler, med enda molekyl upplösning.
Originalet in situ experiment för att visualisera nukleinsyror används radiomärkta RNA-prober för att sondera DNA-element. Dessa inkluderade visualisera ribosomal DNA i äggstockarna hos grodan Xenopus laevis 2 och satellit-DNA i musvävnad 3. Den första fluorescent in situ experiment använde en RNA-molekyl märkt med en fluorofor att sondera särskilda DNA-sekvenser 4. Den första tillämpningen av fluorescerande prober för visualisering av RNA in situ var visualisering av aktin genuttryck i kycklingmuskel vävnadskultur 5. På senare tid, i knoppande jäst har FISH använts för att undersöka oscillationer i transkription under jästen metabolisk cykel 6, sönderfallet av mRNA under cellcykelns framskridande 7, och spatial lokalisering av mRNA-transkript under mitos 8. FISH har använts i jäst för att visa att okorrelerade fluktuationer i konstitutivt transkriberade gener, som utgör mer än hälften av alla jästgener, uppstår okorrelerade transkriptionsinitiering 9. I icke-jäst arter, har FISH använts för att identifiera stamceller markörer i musen tarmen 10 och att fastställa att ofullständig penetrans av cell öden kan resultera från stokastiska fluktuationer genuttryck i C.elegans embryon 11.
FISH här beskrivna metoden fungerar genom hybridisering färgämnesmärkta, enkelsträngade DNA-prober till mRNA meddelanden. Celler avbildas och mRNA räknas med hjälp av en fläck-detektering algoritm. Enkelsträngade prober kan genereras med en DNA-syntetisator och därefter märkta (här kallad Singer prober) eller beställas kommersiellt som pre-märkta prober (Stellaris prober) 12,13. En stor skillnad mellan sångaren och Stellaris sonder är att sångaren sonderna är längre (~ 50 bp) och är multi-märkta medan Stellaris sonder är korta (~ 20 bp) med endast en etikett per sond, som beskrivs av Raj et al 14. Dessutom använder Stellaris tillvägagångssätt många fler sonder per gen än det av Singer (~ 30 kontra 5 sonder per gen, respektive). Nedan ger vi ett protokoll som beskriver användningen av endera typen av prob. I avsnitt 2, tillhandahåller vi ett protokoll för märkning amino-allyl tymidin-innehållande prober wed en vald Cy färgämne. En översikt över de beräkningssteg som krävs för att identifiera enskilda mRNA fläckar finns i avsnitt 7.
Hittills har FISH främst varit en låg genomströmning. Användningen av Cy3, Cy3.5 och Cy5 färgämnen begränsar antalet gener man kan undersöka i enstaka celler till tre åt gången. Några ytterligare prober har utvecklats (Stellaris) men antalet urskiljbara prober är fortfarande högst sju. För att kringgå denna begränsning, har kombinatoriska märkning strategier med hjälp av multipla fluoroforer använts för att skapa streckkoder för olika mRNA 19,20. Senast använde Lubeck och Cai optisk och spektrala barcoding att kvantifiera 32 olika arter samtidigt med fisk i enstaka jästceller 19. En begränsning med denna senaste kombinatoriska tillvägagångssättet är det kräver användning av super-resolution mikroskopi. Den analys som krävs för att särskilja de streckkodade sonderna är också ganska komplex.
Vi har funnit att Cy3 och Cy3.5 är att föredra framför Cy5 för fisk experiment. En av begränsningarna i Cy5 färgämnet är dess känslighetatt fotoblekning. Dock har Stellaris nyligen utvecklats Cy5 varianter som marknadsförs som mer motståndskraftiga mot fotoblekning, och kan lindra denna tekniska fråga. Det är också värt att notera att fisk är en dyr metod för att genomföra och att både sångare och Stellaris prober vanligtvis kostar $ 700 – $ 1.000 per probe set, även om priserna för kommersiellt tillgängliga prober bör minska i framtiden. Avvara av reagenser och effektiv märkning ger Singer sonder ner till det lägre intervallet i pris.
En av de stora tekniska utmaningarna är separationen av enstaka kontra flera sond fläckar, vilket kräver genomförandet av sofistikerade spot-fastställande algoritmer. Detta kan ta omfattande manuell granskning för att ställa parametrar bildanalys för specifika experimentella uppställningar. En översikt av vårt computational pipeline med relevanta MATLAB-funktioner finns i avsnitt 7 i protokollet. Denna fråga är något lindras genom Stellaris sonder som endast har en etikett per sond. Det kräver därför colocalization av flera sonder för att se en signal.
Eftersom FISH kräver fastställande celler, inte underlätta det inte spåra enskilda celler över tiden. Tidigare använde vi uppgifter FISK snapshot att rekonstruera dynamiken i genuttryck i enskilda metaboliskt populationer cykling jäst 6. Metabola cykling observeras i pre-svalt, kontinuerliga odlingar, och kännetecknas av befolkningen hela kollektiva svängningar i syreförbrukning. Dessa svängningar är förknippade med genomet hela svängningar av transkript som uppstår för hälften av alla jästgener vid olika faser av syreförbrukning. Vi försökte att avgöra om metabola cykling var närvarande i osynkroniserade kontinuerliga jästkulturer. Om närvarande bör transkript som är anti-korrelerade i synkrona populationer också anti-korrelerade i osynkroniserade enskilda celler, och vice versa för korrelerade transkript.
ENT "> Att rekonstruera dynamiken i mRNA-produktion i tid, måste de observerade snapshot data jämföras med vad som förväntas av en modell av det underliggande beteendet. Det finns teoretiska begränsningar när sådana" ögonblicksbilder "av genuttrycksdata kan användas för att bestämma de underliggande genuttryck dynamik och vilka typer av modeller kan urskiljas 21. För de metaboliska cykeldata, snarare än direkt visar närvaron av tidsmässiga svängningar, har statistiska mätningar genomförs för att styrka att det faktiskt finns en cell autonom oscillerande program överensstämmer med bulk microarray mätningar.The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har finansierats med bidrag GM046406 (DB) och National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM erkänner finansiering från NSF Graduate Research Fellowship. MNM stöds av en Lewis-Sigler Fellowship. Vi vill tacka medlemmarna i Botstein labbet för bra diskussioner och tidigare medlemmar Allegra Petti och Nikolai Slavov för deras bidrag till den metaboliska cykeln projektet. Vi tackar Daniel Zenklusen och Robert Singer för att få oss började med FISH-metoden.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |