Дизайн двухосных механических биореактор загрузка для тканевой инженерии
Summary
Мы разработали новую механической загрузки биореактора, которые могут применяться одноосные или двухосные механические напряжения хряща биокомпозитные до трансплантации в дефекта суставного хряща.
Abstract
Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Пока устройство в основном функционирует в качестве биореактора, который имитирует родной механических напряжений, он также оснащен датчиком нагрузки для обеспечения обратной силы или механических испытаний конструкций. Устройство субъектов инженерии хряща конструкции для двухосных механических нагрузках с большой точностью нагрузочной дозы (амплитуда и частота) и достаточно компактен, чтобы поместиться внутри стандартной культуре ткани инкубатора. Он загружает образцов непосредственно в планшет для тканевых культур и разных размеров пластины совместимы с системой. Прибор был разработан с использованием компонентов, выпускаемых для высокоточного применения лазеров. Би-осевой нагрузки осуществляется двумя ортогональными этапов. Ступени имеют 50 мм Диапазон перемещения и приводятся в действие независимо от шаговых приводов двигателя, контролируемогозамкнутой шаговым двигателем водитель, который имеет микро-шаговый возможности, что позволяет шаг размерами менее 50 нм. Полисульфона загрузки валик соединен с двухосной подвижной платформе. Перевозкой этапы контролируются Тор-Labs Расширенные технологии позиционирования (APT) программного обеспечения. Драйвер шагового двигателя используется вместе с программным обеспечением для настройки параметров нагрузки от частоты и амплитуды и сдвиг и сжатие независимо и одновременно. Позиционная обратная связь обеспечивается линейными оптическими датчиками, которые имеют двунаправленный повторяемости 0,1 мкм и разрешением 20 нм, переводя к позиционной точностью менее 3 мкм по всей 50 мм хода. Эти датчики обеспечивают необходимую обратную связь по положению на электронику винчестера обеспечения подлинной нанопозиционирования возможностями. Для обеспечения обратной связи по усилию для обнаружения контакта и оценивать загрузку реакций, точность миниатюрного датчика нагрузки расположена между валиком загрузки и двигаешьсяг платформы. Датчик обладает высокой точностью 0,15% до 0,25% от полной шкалы.
Introduction
Мы разработали загрузки биореактора, что позволяет наносить одноосной или двухосной механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Это устройство предназначено главным образом в качестве биореакторов для инженерии замены суставного хряща, она также может быть использована для других несущих тканей в организме человека. Наша мотивация в этом биореакторе дизайна связано с Drachman и Соколов 1, который сделал семенные наблюдения аномальных формирование суставного хряща в парализованном куриных эмбрионов из-за отсутствия движения. Кроме того, физические упражнения необходимы для нормального развития мышц и костей. В соответствии с этой концепцией, многие исследовательские группы исследовали, как различные виды физических раздражителей во время выращивания в пробирке модулирует биохимические и механические свойства клеточного биоматериала биокомпозитами и ткани эксплантов 2-7. Понятие функциональной тканевой инженериивключает в пробирке использованием механических стимулов для повышения функциональных свойств тканей, т.е. механические свойства, которые позволяют ткани выдерживать ожидаемые в естественных условиях стресса и напряжение 8,9. Многочисленные исследования сообщают об использовании механической нагрузки в терминах сдвига и сжатия, чтобы стимулировать инженерных конструкций хряща суставных соединений. Mauck соавт. 10 показывают, что механическая нагрузка может вызвать только хондрогенезе мезенхимальных стволовых клеток даже в отсутствие факторов роста, которые считаются жизненно важными. Применение прерывистой механической нагрузки, такие как сжатие или сдвиг во время культивирования тканей было показано, модулирует хрящевой и костной формации, однако оптимальный дозиметрии нагрузки отличается от клеток и тканей свойствами 11.
Наиболее важная функция суставного хряща является способность выдерживать сжатие и поперечных сил всустава, поэтому он должен иметь высокой прочностью на сжатие и модуля сдвига. Отсутствие функциональной механической прочности и физиологический ультраструктуры инженерии хрящей привело к распаду на нео-хрящ в естественных условиях и неспособность хряща замены стратегии в суставах. Хотя сжатия и сдвига были широко продемонстрированы для модуляции и улучшить механическую прочность биокомпозитов суставного хряща, комбинированный подход редко 6,12-15. Wartella и Уэйн 16 разработан биореактора, которые применяются растяжение и сжатие производить замены мениска хрящ. Вальдман соавт. 15 разработаны устройства применить сжатия и сдвига в хондроциты культивировали в пористой подложке, полифосфат кальция. Бянь соавт. 17 продемонстрировано соответствие механических свойств хряща с родным в пробирке выращивания взрослых собачьих хондроцитов в гелях и применение двухосных мехветствующий квантовомеханический нагрузки (сжатие деформационных нагрузка на контакт и раздвижные нагрузки).
Двухосных механических биореактор загрузки был первоначально разработан Даниэль Чу в нашей лаборатории с общей целью, чтобы вызвать морфологических адаптаций в тканевой инженерии хряща строит приводит к повышению на сжатие и модуля сдвига, чем в настоящее время 18. Мы считаем, что это исследование позволит значительно увеличить наши широком понимании того, как механотрансдукция можно модулировать спроектировать клинически значимых тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерных конструкций изготовлены для трансплантации. Устройство может быть использовано в качестве биореакторов для выращивания в пробирке инженер…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена при поддержке Управления научных исследований и развития, RR & D службы департамента США по делам ветеранов, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 и Министерство обороны W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
Referências
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
