Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos
Summary
Hemos diseñado un nuevo biorreactor de carga mecánica que se puede aplicar tensión mecánica uniaxial o biaxial a un biocompuesto cartílago antes del trasplante en un defecto de cartílago articular.
Abstract
Hemos diseñado un dispositivo de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial a un tejido biocomposites de ingeniería fabricados para el trasplante. Mientras que el dispositivo funciona principalmente como un biorreactor que imita las cepas nativas mecánicos, sino que también está equipado con una célula de carga para proporcionar retroalimentación de fuerza o pruebas mecánicas de los constructos. Los sujetos de dispositivos diseñados construcciones cartílago a cargas mecánicas biaxial con gran precisión de la dosis de carga (amplitud y frecuencia) y es lo suficientemente compacto como para caber en un cultivo de tejidos incubadora estándar. Se carga muestras directamente en una placa de cultivo de tejidos, y múltiples tamaños de placa son compatibles con el sistema. El dispositivo ha sido diseñado utilizando componentes fabricados para aplicaciones de láser de precisión guiadas. Carga biaxial se lleva a cabo por dos fases ortogonales. Las etapas tienen un rango de desplazamiento de 50 mm y se conducen de forma independiente por actuadores de motor paso a paso, controlados porun controlador de bucle cerrado del motor paso a paso que dispone de capacidades de micro paso a paso, lo que permite tamaños de paso de menos de 50 nm. Un polisulfona carga plato se acopla a la plataforma en movimiento biaxial. Los movimientos de las etapas están controladas por Thor-labs software Tecnología Avanzada de Posicionamiento (APT). El controlador de motor paso a paso se utiliza con el software para ajustar los parámetros de carga de frecuencia y amplitud tanto de cizallamiento y compresión de forma independiente y simultánea. Retroalimentación posicional es proporcionado por codificadores ópticos lineales que tienen una repetibilidad bidireccional de 0,1 micras y una resolución de 20 nm, que se traduce en una precisión posicional de menos de 3 micras más de la plena 50 mm de recorrido. Estos encoders proporcionan la retroalimentación de la posición necesaria para la electrónica de guía para garantizar verdaderas capacidades nanopositioning. A fin de proporcionar la retroalimentación de fuerza para detectar y evaluar las respuestas de contacto de carga, una célula de carga en miniatura de precisión se coloca entre el rodillo de carga y el Movinplataforma de g. La célula de carga tiene altas precisiones de 0.15% a 0.25% de la escala completa.
Introduction
Hemos diseñado un biorreactor de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial a un tejido biocomposites de ingeniería fabricados para el trasplante. Este dispositivo está diseñado principalmente como un biorreactor para los reemplazos de ingeniería de cartílago articular, sino que también podría ser utilizado para otros tejidos de soporte de carga en el cuerpo humano. Nuestra motivación en este diseño de bioreactor se deriva de Drachman y Sokoloff 1, que hizo la observación fundamental de la formación anormal del cartílago articular en embriones de pollo paralizadas debido a la falta de movimiento. Del mismo modo, el ejercicio físico es esencial para el desarrollo normal de los músculos y de los huesos. De acuerdo con este concepto, muchos grupos de investigación han estudiado cómo los diferentes modos de estímulos físicos durante el cultivo in vitro modula las propiedades bioquímicas y mecánicas de biocomposites células biomateriales y explantes tisulares 2-7. El concepto de ingeniería de tejidos funcionalesimplica el uso in vitro de los estímulos mecánicos para mejorar las propiedades funcionales de los tejidos, es decir, las propiedades mecánicas que permiten que el tejido para soportar la espera pt el estrés y la tensión in vivo 8,9. Numerosos estudios reportan el uso de carga mecánica en términos de esfuerzo cortante y compresión para estimular cartilaginosas construcciones de ingeniería para uniones articulares. Mauck et. Al 10 sugieren que la carga mecánica por sí sola puede inducir condrogénesis de células madre mesenquimales, incluso en ausencia de factores de crecimiento que se consideran vitales. Aplicación de carga mecánica intermitente tales como la compresión o cizalladura durante el cultivo de tejidos se ha demostrado que modulan la formación de hueso y cartílago, sin embargo, la dosimetría óptima de la carga difiere con las propiedades del tejido celular y 11.
La función más importante del cartílago articular es la capacidad de soportar fuerzas de compresión y de cizallamiento dentro dela articulación, por lo tanto, tiene que tener una alta compresión y módulos de cizallamiento. La falta de resistencia mecánica y funcional ultraestructura fisiológica en el cartílago de ingeniería ha dado lugar a la ruptura sobre el neo-cartílago in vivo y el fracaso de las estrategias de sustitución de cartílago en las articulaciones. Aunque la compresión y cizallamiento se han demostrado comúnmente para modular y mejorar la resistencia mecánica de biocomposites cartílago articular, un enfoque de combinación es rara 6,12-15. Wartella y Wayne 16 diseñaron un biorreactor que aplica tensión y la compresión para producir reemplazos de cartílago del menisco. Waldman et al. 15 diseñado un dispositivo para aplicar una compresión y cizallamiento a los condrocitos cultivados en un sustrato de polifosfato de calcio poroso. . Bian et al 17 demostró propiedades mecánicas del cartílago nativo que coincidan con el cultivo in vitro de los condrocitos caninos adultos en geles y aplicación de mecanismos biaxialmecánicos de carga (compresión deformacional carga y deslizamiento de carga de contacto).
El biorreactor carga mecánica biaxial fue diseñado originalmente por Danielle Chu en nuestro laboratorio con el objetivo general para inducir adaptaciones morfológicas en el tejido del cartílago ingeniería construye resulta en mayores módulos de compresión y cizallamiento que en la actualidad dispone de 18. Creemos que esta investigación se incrementará significativamente nuestra comprensión más amplia de cómo mechanotransduction puede ser modulada para diseñar tejidos clínicamente relevantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos diseñado un dispositivo de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial para construcciones de ingeniería de tejidos fabricados para el trasplante. El dispositivo se puede utilizar como un biorreactor para el cultivo in vitro de biocomposites ingeniería o como un dispositivo de prueba para describir las características mecánicas del tejido nativo o después de otros tratamientos previos a. Los sujetos de dispositivos diseñados construcciones de tejido a una carga …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigación y Desarrollo, RR + D Service, Departamento de Asuntos de Veteranos de EE.UU., NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 y el Departamento de Defensa W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
Referências
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
