Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

Summary

Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.

Abstract

Desenvolvemos uma técnica para isolar e processar o tecido gengival murino por citometria de fluxo, os estudos moleculares e com precisão. A gengiva é um tecido único e importante para estudar os mecanismos imunitários, porque está envolvido na resposta imune do hospedeiro contra o biofilme oral, que podem provocar doenças periodontais. Além disso, a proximidade da gengiva para o tecido do osso alveolar também permite estudar a remodelação óssea em condições inflamatórias. Nosso método produz grande quantidade de células do sistema imunológico que permite a análise de até populações raras células, tais como células de Langerhans e células T reguladoras como demonstramos anteriormente ^1. Empregando ratinhos para estudar as respostas imunitárias locais envolvidos na perda de osso alveolar durante as doenças periodontais, é vantajoso, devido à disponibilidade de várias ferramentas imunológicas e experimental. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente para a gengiva murino, muitos estudos evitada exame de this tecidos críticos. O método descrito neste trabalho podem facilitar a análise de gengiva, que poderá aumentar a atenuante no sistema imunitário por via oral e o seu papel durante as doenças periodontais.

Introduction

Gengiva é o tecido macio em torno da porção cervical dos dentes e cobre o processo alveolar (Figura 1). A gengiva é um tipo de mucosa mastigatória que podem ser ainda separadas no epitélio da mucosa e do tecido conjuntivo (também conhecido como submucosa ou lâmina). A estrutura anatômica da gengiva e dentes adjacentes permite que as bactérias para residir e desenvolver placa (biofilme) que desafia constantemente o sistema imunológico local. Como resultado, a resposta inflamatória desenvolve na gengiva, o que, em determinadas circunstâncias torna-se destrutiva - uma situação designada por doenças periodontais ^2. Basicamente, patologias peri....

Protocol

Prepare-se com antecedência:

• PBS + FCS a 2%
• PBS + FCS a 2% com 2 mg / ml de colagenase de tipo II e de 1 mg / ml de ADNase tipo I (1 ml para cada amostra)
• Instrumentos cirúrgicos esterilizados
• Solução de EDTA 0,5 M

1. Superior Técnica Excisão Gengival

1. Eutanásia ratos usando orientação IACUC aprovado.
2. Corte ambos os lados da cavidade oral, incluindo as bochechas e do ramo da mandíbula com uma acentuada / blunt tesoura reta.
3. Puxe para baixo a mandíbula.
4. Cortar os tecidos moles e duros por uma linha imaginária que 1 milímetro atrás dos molares terços pa....

Results

São apresentados exemplos de análise de citometria de fluxo em células gengivais. Células gengivais agrupados a partir de dois ratos foram executados em um citômetro de fluxo LSR II e analisados ​​usando o software FlowJo. Figura 3A demonstrou a distribuição de células gengivais de camundongos ingênuos em uma dispersão lateral (SSC) em relação ao gráfico de dispersão (FSC). Gating estratégia para identificar (i) os linfócitos (ii) os monócitos / células dendríticas e (iii) os granulócitos é indicado. Pa.......

Discussion

Tecidos gengivais Maxilla obtidos a partir de um único rato são suficientes para análise de sub-populações de linfócitos T e B, bem como a sua capacidade para expressar moléculas extracelulares e intracelulares, como previamente descrito ^1. No entanto, se as populações de células raras são de interesse (por exemplo, DCs), recomenda-se a tecidos de piscina 2-3 ratinhos. De nota, se preferível, é possível descascar ambos os tecidos gengivais e palatal e, depois, para extirpar a gengiva (uma modificação do passo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colagenase Tipo II	Worthington Biochemical Corp.	CLS-2
DNAse I	SIGMA	DN25-1G
EDTA	SIGMA	E6758-100G
Dulbecco's PBS	SIGMA	D8537
Soro Fetal Bovino	Biological Industries	04-121-1	Filtro Inativado a Vácuo por Calor
Jet	Biofil	FPE-204-500
5 ml Poliestireno Fundo Redondo Tubo	BD Falcon	352052
Cell Strainer 70 μ m	SPL Lifesciences	93070
Placa de Cultura de Tecidos 35× 10 mm	NUNC	153066
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714
Anticorpo anti-camundongo CD11c	Biolegend	117305	Clone N418
Anticorpo anti-camundongo CD45.2	Biolegend	109819	Clone 104
Anticorpo anti-camundongo CD4	Biolegend	100413	Clone GK1.5
Anticorpo anti-camundongo CD8a	Biolegend	100733	Clone 53-6.7
Anticorpo CD3 anti-rato	Biolegend	100214	Clone 17A2
Anti-rato CD326 (Ep-CAM) Anticorpo	Biolegend	118219	Clone G8.8
Anti-rato CD207 (Langerina) Anti-rato		DDX0362D	Clone 929F3.01
Anti-rato I-Ad (MHC-II) antocorpo	Biolegend	115010	Clone 39-10-8
LSR II Citômetro de Fluxo	BD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5	Tree Star