Summary

加速1型糖尿病感应在小鼠体内的过继转移致糖尿病的CD4 + T细胞

Published: May 06, 2013
doi:

Summary

我们提供了一个可重复的方法,诱导1型糖尿病(T1D)在小鼠胰岛抗原特异性的,初级的CD4 + T细胞过继转移在两个星期内。

Abstract

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病12周龄后,是最广泛研究的动物模型,人类1型糖尿病(1型糖尿病)。照射的受体小鼠的细胞转移的研究已经建立了1型糖尿病的发病机制在这个模型中,T细胞的关键。我们描述一个简单的方法迅速诱发T1D继转移纯化,小学的CD4 + T细胞前糖尿病NOD小鼠胰岛特定的T细胞受体(TCR)BDC2.5到NOD.SCID受体小鼠的转基因。这种技术的主要优点是可以在同一天,不要求收件人照射型糖尿病的发病率很高,引起T细胞转移后2周内完成隔离和致糖尿病性T细胞过继转移。因此,研究可以继续以更快的速度比I型糖尿病的发病机理和治疗干预的方法依赖于异质性T细胞群或克隆来自糖尿病NOD小鼠。

Introduction

NOD小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病,并已被广泛用作人I型糖尿病的动物模型1,2。 I型糖尿病NOD小鼠的发病机制中的浸润,其特征在于,开始在3-4周的年龄,胰腺胰岛的树突状细胞和巨噬细胞,T细胞和B细胞。这一阶段的非破坏性的周边胰岛炎导致一个缓慢的,逐渐产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏,从而导致明显的糖尿病,由4-6个月3岁。已转让4,5脾细胞,CD4 + 6,7或CD8 + 8,9糖尿病NOD小鼠T细胞介导糖尿病NOD小鼠免疫功能低下,表明胰岛反应性T细胞在1型糖尿病的发病机制中发挥了核心作用。根据不同的实验条件下,糖尿病受体小鼠发展缓慢,在几个星期内,在这些研究中。同样,来自不同的T细胞克隆,费时和昂贵的致糖尿病性T细胞的培养,已报告的几个星期后,转移到受体小鼠7,10介导糖尿病。随着转基因小鼠表达的TCR来自CD4或CD8限制的致糖尿病的T细胞克隆,一些实验室的可用性,其后已表明,从小鼠脾脏T细胞能够转移糖尿病收件人11-13。具体来说,NOD小鼠BDC2.5只转基因BDC2.5 TCR,这是具体 ​​的嗜铬粒蛋白A,胰腺β细胞中的一种蛋白质14-16。 在体外激活或者未激活的全部或分馏公然糖尿病或糖尿病前期BDC2.5糖尿病小鼠转移到新生儿或免疫缺陷的NOD小鼠在不同的效率11,17-19脾细 ​​胞的转移。

我们描述了一个简单的方法,利用纯化的转基因的CD4 + T细胞在高效率和consiste的受体小鼠诱导T1D从糖尿病前期BDC2.5小鼠NCY。从这些小鼠中分离大量的幼稚,胰岛抗原特异性CD4 + T细胞通过荧光激活细胞分类(FACS),CD4 + CD62L + T细胞表达的转基因TCRVβ4的链。纯化的转基因T细胞,然后转移无需激活到NOD.SCID的老鼠,缺乏功能性T细胞和B细胞和胰岛炎和糖尿病无20。受体小鼠进行监测尿糖浓度升高,表明I型糖尿病,迅速发展后两周内的T细胞转移。

相比之下致糖尿病异构特异性T细胞转移的其他方法,我们的协议,使用流式细胞仪排序CD4 + T细胞,几乎完全表达的致糖尿病BDC2.5的TCR。由于他们的同质性,只有少数转移T细胞(约1×10 6个细胞/鼠标)T1D发展迅速,需要2个星期内,在100%的发病率。我们的协议的另一个优势是,irradiation的受体小鼠是没有必要的,因为它是为一些其他的方法。这种方法的一个潜在的局限性,它并没有允许调查,CD4和CD8 + T细胞亚群,或特别是CD8 + T细胞在糖尿病的贡献。

所描述的协议将是有用的研究的T1D的快速发展,介导的幼稚的,单特异性CD4 + T细胞,以及治疗策略干预胰岛抗原特异性的Th细胞的归巢至靶器官。

Protocol

1。从脾和淋巴结肿大BDC2.5小鼠的T细胞的分离使用6周龄糖尿病前期致糖尿病的CD4 + T细胞的捐助者的的女BDC2.5小鼠。应该是无糖尿病老鼠尿葡萄糖测定(见下文)所确定的。 安乐死每个鼠标采用CO 2窒息,在无菌条件下取出脾脏,腋窝和肱淋巴结。要取出脾脏,用70%乙醇浸泡皮草,再切和缩回皮肤。脾将是可见的,为暗红色的器官上的左侧的鼠标。 1英寸腹膜切口用小剪刀?…

Representative Results

我们的研究结果表明隔离的转基因BDC2.5细胞表达CD62L,这是家二级淋巴器官,如胰腺淋巴结T细胞的关键。我们的研究结果进一步证明了强有力的能力,这个单特异性T细胞的人口转移迅速和有效地T1D到NOD.SCID受体小鼠。 图2中所示的分离的致糖尿病CD4 + T细胞源自BDC2.5老鼠的。每股供体小鼠细胞分选前获得约5×10 7细胞汇集脾和淋巴结肿大。流式细胞仪排序之…

Discussion

1型糖尿病可以诱发受体小鼠的整个糖尿病NOD小鼠或来自致糖尿病性T细胞克隆的TCR转基因小鼠的脾细胞或T细胞亚群的过继转移在不同的效率。我们在此报告可重复的方法,在两周内100%的发病率在受体小鼠诱发T1D通过流式细胞仪纯化CD62L + BDC2.5转基因的CD4 + T细胞的转移到NOD.SCID小鼠。

这里所描述的特定优势的BDC2.5 T细胞传输模型,包括诱导时间很短,相比T1D月自发糖尿病和糖…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢博士。罗伯特BONNEAU和尼尔·克里斯滕森有益的意见。

这项工作是由美国宾夕法尼亚州立大学医学院的资金支持。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) JAX 004460  
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) JAX 001303  
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Themo Scientific SH30022.01  
Bayer Diastix Fisher Scientific AM2803  
15 ml conical tubes Falcon 352095  
50 ml conical tubes Falcon 352070  
Sterile surgical tweezers      
Sterile small pair scissors      
Sterile large pair scissors      
70 μm cell strainers Fisher Scientific 22363548  
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235  
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer     0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O
BD FACSFlowTM sheath fluid BD Biosciences 342003  
FACS staining buffer     PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized
Phase contrast microscope      
Trypan blue      
Hemocytometer      
Anti-CD4 (APC) mAb Biolegend 1005616 clone RM4-5
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb BD Biosciences 553365 clone KT4
Anti-CD62L (PE) mAb BD Biosciences 553151 clone MEL-14
Cell sorter BD Biosciences   e.g. BD FACSAria III
Heat lamp      
Mouse restrainer      
1 ml syringes Becton Dickinson 309602  
18-1½ gauge needles (sterile) Becton Dickinson 305196  
27½ gauge needles (sterile) Becton Dickinson 305109  

Referências

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Citar este artigo
Berry, G., Waldner, H. Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells. J. Vis. Exp. (75), e50389, doi:10.3791/50389 (2013).

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