Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.
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Artigo de método
Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +
Neste artigo
Resumo
Resumo
O diabético (NOD) do mouse não obesos espontaneamente desenvolve diabetes auto-imune após 12 semanas de idade e é o modelo animal mais estudada do ser humano diabetes tipo 1 (DM1). Estudos de transferência de células em ratinhos receptores irradiados têm demonstrado que as células T são fundamentais na patogénese T1D neste modelo. Descrevemos aqui um método simples para rapidamente induzir T1D por transferência adoptiva de purificada, as células T a partir de ratinhos NOD pré-diabéticos transgénicas para o receptor de células T específico de ilhota (TCR) BDC2.5 em ratinhos receptores NOD.SCID CD4 + primárias. As principais vantagens desta técnica são que o isolamento e transferência adoptiva de células T diabetogênicas pode ser concluída no mesmo dia, a irradiação dos destinatários não é necessária, e uma elevada incidência de DM1 é induzida dentro de 2 semanas após a transferência de células T. Assim, os estudos de patogénese e intervenções terapêuticas DM1 pode prosseguir a uma velocidade mais rápida do que com os métodos que se baseiam em populações heterogéneas de células T ou clonesderivados de ratinhos NOD diabéticos.
Introdução
O ratinho NOD espontaneamente desenvolve a diabetes auto-imune e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal para 1,2 T1D humano. Patogénese de DM1 em ratinhos NOD é caracterizada pela infiltração de, com início às 3-4 semanas de idade, dos ilhéus pancreáticos de Langerhans por macrófagos e células dendríticas, seguido de células T e B. Esta fase de não-destrutiva peri-insulite leva à destruição lenta e progressiva das células β pancreáticas produtoras de insulina, o que resulta em diabetes evidente por 4-6 meses de idade 3. A transferência de esplenócitos de 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 As células T de ratinhos NOD ....
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Protocolo
1. Isolamento de células T de baço e linfonodos de BDC2.5 Mice
- Use 6 semanas de idade pré-diabéticos do sexo feminino BDC2.5 ratos como doadores de células T CD4 + diabetogênicos. Os ratos devem estar livre de diabetes, conforme determinado por medição de glucose na urina (ver abaixo).
- Eutanásia cada rato usando asfixia CO 2 e remover o baço, axilar e braquial gânglios linfáticos sob condições estéreis. Para remover o baço, mergulhe a pele com álcool 70%, em seguida, cortar e retirar a pele. O baço será visível como um órgão de vermelho escuro sobre o lado esquerdo do rato. Adicione uma incisão de 1 cm no peritoneu utilizando as pequen....
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Resultados
Os nossos resultados mostram o isolamento de células que expressam transgénicos BDC2.5 CD62L, o qual é crítico para as células T para a casa de órgãos linfóides secundários, tais como os nódulos linfáticos pancreáticas. Os resultados demonstram ainda a capacidade potente desta população de células T monoespecífico para transferir rápida e eficientemente a T1D ratinhos receptores NOD.SCID.
Isolamento de células T CD4 + células T diabetogênicas BDC2.5 de ratinhos é mostrado na Figura 2.......
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Discussão
DM1 pode ser induzida em ratinhos receptores em diferentes eficiências de transferência adoptiva de células do baço inteiro ou subconjuntos de células T a partir de ratinhos NOD diabéticos ou ratinhos transgénicos para TCRs derivados de clones de células T diabetogênicas. Nós relatamos aqui um método reprodutível para induzir DM1 em camundongos receptores dentro de duas semanas a 100% de incidência, transferindo FACS-purificadas CD62L + BDC2.5 CD4 + células T transgênicos em camundongos NOD.SCID.
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Divulgações
Todos os animais foram alojados na Penn State College of livre de patógenos instalação específica Medicine (SPF), de acordo com as diretrizes da Penn State Institutional Animal Care e do Comitê Use.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos drs. Robert Bonneau e Neil Christensen pelos comentários úteis.
Este trabalho foi apoiado pela Pennsylvania State University College of Medicine fundos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos transgênicos BDC 2.5 TCR NOD (NOD. Cg-Tg(Tcrα BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD. Camundongos SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Falcon | 352095 | |
| Tubos cônicos de 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Pinças cirúrgicas estéreis Tesouras | |||
| pequenas estéreis Tesouras | |||
| grandes estéreis | |||
| 70 μ filtros de células m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μ tubos de tampa de filtro de células m | BD Biosciences | 352235 | |
| tampão | 0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 em dH2O | ||
| BD FACSFlowTM fluido de bainha | BD Biosciences | 342003 | |
| tampão | de coloração FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, esterilizado com filtro | ||
| Microscópio | |||
| Azul | |||
| Hemocitômetro | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Classificador de células | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Lâmpada | |||
| Limitador | |||
| rato Seringas de 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ agulhas de calibre (estéreis) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ agulhas de calibre (estéreis) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011....
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Reimpressões e permissões
