Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +
Summary
Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.
Abstract
O diabético (NOD) do mouse não obesos espontaneamente desenvolve diabetes auto-imune após 12 semanas de idade e é o modelo animal mais estudada do ser humano diabetes tipo 1 (DM1). Estudos de transferência de células em ratinhos receptores irradiados têm demonstrado que as células T são fundamentais na patogénese T1D neste modelo. Descrevemos aqui um método simples para rapidamente induzir T1D por transferência adoptiva de purificada, as células T a partir de ratinhos NOD pré-diabéticos transgénicas para o receptor de células T específico de ilhota (TCR) BDC2.5 em ratinhos receptores NOD.SCID CD4 + primárias. As principais vantagens desta técnica são que o isolamento e transferência adoptiva de células T diabetogênicas pode ser concluída no mesmo dia, a irradiação dos destinatários não é necessária, e uma elevada incidência de DM1 é induzida dentro de 2 semanas após a transferência de células T. Assim, os estudos de patogénese e intervenções terapêuticas DM1 pode prosseguir a uma velocidade mais rápida do que com os métodos que se baseiam em populações heterogéneas de células T ou clonesderivados de ratinhos NOD diabéticos.
Introduction
O ratinho NOD espontaneamente desenvolve a diabetes auto-imune e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal para 1,2 T1D humano. Patogénese de DM1 em ratinhos NOD é caracterizada pela infiltração de, com início às 3-4 semanas de idade, dos ilhéus pancreáticos de Langerhans por macrófagos e células dendríticas, seguido de células T e B. Esta fase de não-destrutiva peri-insulite leva à destruição lenta e progressiva das células β pancreáticas produtoras de insulina, o que resulta em diabetes evidente por 4-6 meses de idade 3. A transferência de esplenócitos de 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 As células T de ratinhos NOD diabéticos têm mostrado mediar a diabetes em ratinhos NOD imunocomprometidos, indicando que as células T reactivas ilhotas desempenham um papel central na patogénese DM1. Dependendo das condições experimentais, desenvolveram diabetes em ratinhos receptores, lentamente, ao longo de várias semanas nestes estudos. Da mesma forma, vários clones de células T, derivadas por demorado e dispendiosocultura de células T diabetogênicas, têm sido relatados para mediar a diabetes várias semanas após a transferência para ratinhos receptores 7,10. Com a disponibilidade de ratinhos transgénicos que expressam TCR derivados de CD4 ou clones de células T CD8 + restritas diabetogênicas T, vários laboratórios têm subsequentemente demonstrado que as células T do baço de tais ratinhos eram capazes de transferir a diabetes aos receptores 11-13. Especificamente, os ratinhos NOD são BDC2.5 transgénico para a BDC2.5 TCR, que é específico para a cromogranina A, uma proteína em células beta pancreáticas 14-16. Transferência de in vitro ativado ou células do baço inteiro ou fracionado não-ativado a partir abertamente diabéticos ou pré-diabéticos BDC2.5 ratos transferidos diabetes em camundongos NOD neonatais ou imunodeficientes em diferentes eficiências 11,17-19.
Nós descrevemos um método simples que utiliza transgênicos CD4 + purificadas células T de pré-diabéticos BDC2.5 ratos para induzir DM1 em camundongos receptores de alta eficiência e Consistency. Grandes números de células T naive, ilhotas CD4 + específicas para o antigénio são isolados a partir destes ratos por separação de células activadas por fluorescência (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expressam a cadeia a de TCR Vβ4 transgénica. Células purificadas transgênicos T são então transferidos sem ativação em camundongos NOD.SCID, que carecem funcionais T e células B e são insulitis e diabetes livre de 20. Os ratinhos receptores são monitorados para elevadas concentrações de glucose na urina, indicando DM1, que se desenvolve rapidamente dentro de duas semanas após a transferência de células T.
Em contraste com outros métodos que transferir células T com especificidades diabetogênicas heterogéneos, o nosso protocolo utiliza células T que expressam quase exclusivamente o diabetogénico BDC2.5 TCR FACS classificados CD4 +. Devido à sua homogeneidade, apenas um pequeno número de células T transferidas (~ 1×10 6 células / rato) são necessários para o desenvolvimento rápido T1D dentro de 2 semanas a 100% de incidência. Outra vantagem é que o nosso protocolo irradiation de ratos destinatário não é necessário, pois é para alguns outros métodos. Uma limitação potencial deste método é que ela não permite a investigação sobre a contribuição de ambas as células T CD8 em diabetes subconjuntos CD4 e CD8 das células T ou especificamente.
O protocolo descrito irá ser útil para estudar o desenvolvimento rápido DM1, mediada por CD4 naive, monoespecíficos + células T, bem como estratégias terapêuticas para intervir na direcção das células Th específicas do antigénio da ilhota para o órgão alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
DM1 pode ser induzida em ratinhos receptores em diferentes eficiências de transferência adoptiva de células do baço inteiro ou subconjuntos de células T a partir de ratinhos NOD diabéticos ou ratinhos transgénicos para TCRs derivados de clones de células T diabetogênicas. Nós relatamos aqui um método reprodutível para induzir DM1 em camundongos receptores dentro de duas semanas a 100% de incidência, transferindo FACS-purificadas CD62L + BDC2.5 CD4 + células T transgênicos em camundongos NOD.SCID.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos drs. Robert Bonneau e Neil Christensen pelos comentários úteis.
Este trabalho foi apoiado pela Pennsylvania State University College of Medicine fundos.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
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