Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico
Summary
Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.
Abstract
El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune después de 12 semanas de edad y es el modelo animal más ampliamente estudiado de humano de tipo 1 diabetes (DM1). Estudios de la transferencia de células en ratones receptores irradiados han establecido que las células T son esenciales en la patogénesis de DT1 en este modelo. Se describe en este documento un método simple para inducen rápidamente DT1 por transferencia adoptiva de purificado, las células T de ratones NOD prediabéticos transgénicos para el receptor de células T islote-específico (TCR) BDC2.5 en ratones receptores NOD.SCID CD4 + primarias. Las principales ventajas de esta técnica son que el aislamiento y transferencia adoptiva de células T diabetogénicos se puede completar en el mismo día, no se requiere la irradiación de los destinatarios, y una alta incidencia de diabetes tipo 1 está provocada dentro de 2 semanas después de la transferencia de células T. Por lo tanto, los estudios de la patogénesis y las intervenciones terapéuticas en DT1 puedan tener lugar a un ritmo más rápido que con los métodos que se basan en poblaciones de células T heterogéneas o clonesderivados de ratones NOD diabéticos.
Introduction
El ratón NOD desarrolla la diabetes autoinmune espontánea y ha sido ampliamente utilizado como un modelo animal para el 1,2 DT1 humana. Patogénesis de la diabetes tipo 1 en ratones NOD se caracteriza por la infiltración, a partir de las 3-4 semanas de edad, de los islotes de Langerhans del páncreas por las células dendríticas y los macrófagos, seguido por las células T y B. Esta fase de no destructiva peri-insulitis conduce a una destrucción lenta y progresiva de las células β pancreáticas productoras de insulina, lo que resulta en la diabetes manifiesta por 4-6 meses de edad de 3 años. La transferencia de esplenocitos CD4 + 4,5, 6,7 o 8,9 CD8 + células T de ratones NOD diabéticos han demostrado mediar en la diabetes en ratones NOD inmunocomprometidos, lo que indica que las células T de islotes reactivos juegan un papel central en la patogénesis de DT1. Dependiendo de las condiciones experimentales, la diabetes desarrollada en ratones receptores lentamente, durante varias semanas en estos estudios. Del mismo modo, varios clones de células T, que se deriven por mucho tiempo y es costosocultivo de las células T diabetogénicas, se han reportado para mediar la diabetes varias semanas después de la transferencia en ratones receptores 7,10. Con la disponibilidad de ratones transgénicos que expresan TCR derivados de varios laboratorios diabetogénicos clones CD8 restringidas de células T CD4-o posteriormente, han demostrado que las células T esplénicas de tales ratones fueron capaces de transferir la diabetes a receptores 11-13. Específicamente, BDC2.5 ratones NOD son transgénicas para la BDC2.5 TCR, que es específico para la cromogranina A, una proteína en las células beta pancreáticas 14-16. La transferencia de las células enteras o fraccionadas no se han activado bazo de abiertamente diabéticos o prediabéticos BDC2.5 ratones transferidos diabetes a ratones NOD neonatales o inmunodeficientes con eficiencias variables 11,17-19 vitro activada o.
Se describe un método simple que utiliza transgénicos CD4 + células T purificadas de pre-diabéticos BDC2.5 ratones para inducir T1D en ratones receptores a alto rendimiento y consistencia. Un gran número de células T ingenuas, islotes CD4 + específicas de antígeno están aislados de estos ratones por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expresan la cadena TCR transgénico de Vβ4. Células T transgénicas purificadas se transfieren a continuación sin activación en ratones NOD.SCID, que carecen de T funcionales y las células B y son-insulitis y la diabetes-libre 20. Los ratones receptores son monitoreados para concentraciones elevadas de glucosa en la orina que indican DT1, que se desarrolla rápidamente dentro de las dos semanas después de la transferencia de células T.
En contraste con otros métodos que transferir las células T diabetogénicas con especificidades heterogéneas, nuestro protocolo utiliza células T que expresan casi exclusivamente la diabetogénico BDC2.5 TCR FACS-ordenados CD4 +. Debido a su homogeneidad, sólo un pequeño número de células T transferidas (~ 1×10 6 células / ratón) se requieren para el desarrollo de DT1 rápida dentro de 2 semanas en el 100% de incidencia. Otra ventaja de nuestro protocolo es que irradiation de los ratones receptores no es necesario, ya que es para algunos otros métodos. Una limitación potencial de este método es que no permite la investigación de la contribución tanto de las células T CD8 en la diabetes CD4 y CD8 subconjuntos de células T o específicamente.
El protocolo descrito será útil para estudiar el desarrollo DT1 rápida, mediada por células T ingenuas, estrategias terapéuticas CD4 + monoespecíficos, así como para intervenir en homing de las células Th específicas de antígeno islotes en el órgano diana.
Protocol
Representative Results
Discussion
DT1 puede ser inducida en ratones receptores a diferentes eficiencias de la transferencia adoptiva de células de bazo completas o subconjuntos de células T de ratones NOD diabéticos o ratones transgénicos para TCR derivados de clones de células T diabetogénicos. Presentamos aquí un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 en ratones receptores dentro de dos semanas en el 100% de incidencia mediante la transferencia de FACS purificados por CD62L + BDC2.5 células T CD4 + en ratones transgénicos NOD.SC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Robert Bonneau y Neil Christensen por sus valiosos comentarios.
Este trabajo fue apoyado por Pennsylvania State University College of Medicine fondos.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
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