Accelerated Type 1 Diabetes induktion i möss genom adoptiv överföring av diabetogen CD4 + T-celler
Summary
Vi tillhandahåller en reproducerbar metod för att inducera typ 1 diabetes (T1D) hos möss inom två veckor genom adoptiv överföring av cellöar antigenspecifika, primära CD4 + T-celler.
Abstract
Den nonobese diabetiker (NOD) mus utvecklar spontant autoimmun diabetes efter 12 veckors ålder och är den mest omfattande djurmodell av human typ 1-diabetes (T1D). Cellöverföring studier i bestrålade mottagande möss har visat att T-celler är svängbara i T1D patogenes i denna modell. Vi beskriver häri en enkel metod för att snabbt inducera T1D genom adoptiv överföring av renat, primära CD4 + T-celler från pre-diabetiska NOD-möss transgena för ö-specifik T-cellreceptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid mottagande möss. De stora fördelarna med denna teknik är att isolering och adoptiv överföring av diabetogena T-celler kan slutföras inom samma dag, är bestrålning av mottagarna inte krävs, och en hög förekomst av T1D framkallas inom 2 veckor efter T-cell överföring. Således kan studier av patogenes och terapeutiska ingrepp i T1D fortsätta i en snabbare takt än med metoder som bygger på heterogena populationer T-cell eller klonerhärrör från diabetiska NOD-möss.
Introduction
NOD-musen utvecklar autoimmun diabetes spontant och har i stor utsträckning använts som en djurmodell för mänsklig T1D 1,2. Pathogenesis av T1D i NOD-möss kännetecknas av infiltration, med början vid 3-4 veckors ålder, av de pankreatiska Langerhanska öar från dendritiska celler och makrofager, följt av T-och B-celler. Denna fas av oförstörande peri-insulitis leder till en långsam, gradvis förstörelse av insulinproducerande celler i bukspottkörteln β, vilket resulterar i konstaterad diabetes efter 4-6 månaders ålder 3. Överföring av splenocyter 4,5, CD4 + 6,7 eller CD8 + 8,9 T-celler från diabetiska NOD-möss har visats förmedla diabetes hos immunsupprimerade NOD-möss, vilket indikerar att ö-reaktiva T-celler spelar en central roll i T1D patogenes. Beroende på de experimentella betingelserna, utvecklade diabetes i mottagarmöss långsamt, under flera veckor i dessa studier. Likaså olika T-cell-kloner, som person med tidsödande och kostsamtodling av diabetogena T-celler, har rapporterats att medla diabetes flera veckor efter överföring till mottagaren möss 7,10. Med tillgången av transgena möss som uttrycker TCR härledda från CD4-eller CD8-begränsade diabetogena T-cellkloner, flera laboratorier har senare visat att mjälten T-celler från dessa möss kunde överföra diabetes till mottagare 11-13. Specifikt BDC2.5 NOD-möss är transgena för BDC2.5 TCR, som är specifik för kromogranin A, ett protein i pankreatiska beta 14-16. Överföring av in vitro-aktiverade eller icke-aktiverade hela eller fraktionerade mjältceller från öppet diabetiker eller prediabetic BDC2.5 möss överförda diabetes till neonatala eller immundefekta NOD-möss med varierande effektivitet 11,17-19.
Vi beskriver en enkel metod som utnyttjar renade transgena CD4 + T-celler från pre-diabetiska BDC2.5 möss för att inducera T1D i recipientmöss med hög effektivitet och consisteNCY. Stort antal av naiva, ö-antigen-specifika CD4 + T-celler isoleras från dessa möss genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för CD4 + CD62L + T-celler som uttrycker den transgena TCR Vβ4 kedjan. Renade transgena T-celler överförs sedan utan aktivering i NOD.scid möss, som saknar funktionella T-och B-celler och är insulitis-och diabetes-fria 20. De mottagande möss övervakas med avseende på förhöjda halter av urin glukos anger T1D, som utvecklar snabbt inom två veckor efter det att T-cell överföring.
I motsats till andra metoder som överföra diabetogena T-celler med heterogena specificiteter, använder våra protokoll FACS-sorterade CD4 + T-celler som nästan uteslutande uttrycker den diabetogena BDC2.5 TCR. På grund av sin homogenitet, är endast ett litet antal överförda T-celler (~ 1×10 6 celler / mus) som krävs för snabb T1D utveckling inom 2 veckor vid 100% incidens. En annan fördel med våra protokoll är att irradiation av mottagande möss är inte nödvändigt eftersom det är för några andra metoder. En potentiell begränsning med denna metod är att den inte tillåter utredningen bidrag både CD4 och CD8 T delmängder cell eller specifikt CD8 T-celler i diabetes.
Den beskrivna protokollet kommer att vara användbart för att studera snabba T1D utveckling, förmedlad av naiva, monospecifika CD4 + T-celler, samt terapeutiska strategier för att ingripa i målsökning av ö-antigen-specifika Th-celler till målorganet.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D kan induceras i recipientmöss vid varierande effektiviteten genom adoptiv överföring av hela mjältceller eller T underuppsättningar cell från diabetiska NOD-möss eller möss transgena för TCRs härledda från diabetogena T-cellkloner. Vi redovisar här en reproducerbar metod för att inducera T1D i recipientmöss inom två veckor på 100% incidens genom överföring av FACS-renade CD62L + BDC2.5 transgena CD4 + T-celler i NOD.scid möss.
Specifika fördelar med BDC2.5 T cellöver…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Robert Bonneau och Neil Christensen för användare kommentarer.
Detta arbete stöddes av Pennsylvania State University College of Medicine fonder.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
