חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS) ממלא תפקיד מכריע במאבק נגד לחץ חיידקים. מאמר זה עוסק בטיהור<em> א coli</em> DPS והפרוטוקול<em> במבחנה</em> Assay מדגים הגנת DPS בתיווך של ה-DNA מפירוק על ידי מיני חמצן תגובתי.
סטרס חמצונים הוא תוצר לוואי בלתי נמנע של חיים אירוביים. חמצן מולקולרי הוא חיוני לחילוף חומרים יבשתיים, אבל זה גם לוקח חלק במספר רב של תגובות מזיקות בתוך אורגניזמים חיים. שילוב של חילוף חומרים אירוביים וברזל, שהוא תרכובת חיונית אחרת לכל חיים, זה מספיק כדי לייצר רדיקלים דרך הכימיה פנטון ולבזות מרכיבים תאיים. השפלה ה-DNA היא לטעון את התהליך המזיק ביותר מעורב רדיקלים תאיים, כתיקון DNA הוא רחוק מלהיות טריוויאלי. Assay שהוצג במאמר זה מציע שיטה כמותית למדידה ולהמחיש את ההשפעה של מולקולות ואנזימים בניזק לדנ"א רדיקלי בתיווך.
Assay הגנת ה-DNA הוא כלי פשוט, מהיר, וחזק לאפיון במבחנה של מאפייני ההגנה של חלבונים או חומרים כימיים. זה כרוך בחשיפת DNA לתגובת חמצון מזיקה והוספת ריכוזים שונים של המתחם של עניין. הצמצום או הגדלה של נזק לדנ"א כפונקציה של ריכוז תרכובת אז דמיין באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. במאמר זה אנו מדגימים את הטכניקה של assay הגנת ה-DNA על ידי מדידת התכונות המגנות של חלבון ה-DNA המחייב מהתאים מורעבים (DPS). DPS הוא מיני פריטין כי הוא מנוצל על ידי יותר מ -300 מיני חיידקים כדי להילחם בעוצמה גורמי לחץ סביבתי. כאן אנו מציגים פרוטוקול טיהור DPS ואת התנאים האופטימליים להערכת assay הגנת ה-DNA על ידי DPS.
יצורים אירוביים כל הזמן צריכים להתמודד עם מיני חמצן תגובתי שיכול לגרום נזק DNA שלהם, כמו גם מולקולות ביולוגיות חיוניות אחרות. כלי רב עוצמה אחד כדי לנטרל את ההשפעות הרעילות של נזק חמצוני הוא חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS). מאז גילויו בשנת 1992 מא 'המורעבת coli תרבות 1, DPS זוהה יותר מ -300 מינים של חיידקים ו2 archaebacteria. upregulation המסיבי של DPS בשלב נייח הופך אותו לחלבון nucleoid הקשורים הגבוהה ביותר בא לידי ביטוי של א ' coli בתנאים רעב 3, 4. בנוסף, DPS הוכח גם לשמר יכולת קיום חיידקים ויושרה DNA במהלך רבים לחצים שונים, כולל הרעבה, ריכוז ברזל גבוה, חשיפה לאור UV, הלם חום, וסטרס חמצוני 5, 6.
מבחינה מבנית, DPS עצמי מקורבים לקומפלקס הומו-oligomeric יציב של 12 מונומרים, Which להרכיב לתוך קליפה חלולה כדורית. החלל הפנימי ~ 4.5 ננומטר הרחב נגיש לחוץ הממס דרך נקבוביות המאפשרים מעבר של מולקולות קטנות 7, והוא יכול לעקל מתכות mineralized כגון ברזל 8. ההשפעה המגנה של DPS נובעת ממספר הפעילויות ביוכימיות, הכוללות לא ספציפי DNA 1 מחייב, פעילות ferroxidase, ואחסון ברזל 8.
מחקר מפורט של פעילויות ביוכימיות המיטיבות של DPS דורש הטיהור הראשון שלה. טיהור DPS היא הליך מורכב, שיש להפריד DPS לא רק מחלבונים אחרים, אלא גם מכל ה-DNA מאוגד 7. תהליך הטיהור האופטימלי שלנו משתמש בטכניקות נפוצות רבות, בהיקף של שתי עמודות החלפת יונים וצעד ממטרים אמוניום סולפט. חילופי חיץ כמה יש צורך, כעקורים מרוכזים מאוד יכולים לזרז את הפתרון בתנאי מלח נמוך. ברגע שהחלבון DPS כבר מטוהר, זה עשוי להיות מיושם למבחנים שמודדים ישירות את פעילותה ferroxidase 8, stoichiometry-DNA מחייב 9, ומנגנונים של ברזל מחייב 10. DPS המטוהר יש גם יישומים פוטנציאליים אחרים. המבנה הכדורי החלול היציב של DPS שימש כפיגומים לאחסון חלקיקים הידרופובי בתוך חלל החלבון 11 ואפילו כתא תגובה לסנתז חלקיקים מגנטיים רומן 12.
היכולת המגנה של DPS לתווך נזק עקב מיני חמצן תגובתי יכולה להיות ברורה וישירה הפגינה באמצעות assay-DNA הגנת 13, 14. בהליך זה במבחנה, מינים רדיקליים מיוצרים כאשר הברזל מזרז השפלה H 2 O 2 דרך הכימיה פנטון. רדיקלים אלו באופן ישיר לפגוע בהווה DNA בתגובה ויכולים להשפיל אותו לחלוטין בריכוזים גבוהים. שתי פעילויות מרכזיות עשויות DPS הן במישרין לנטרל את ההשפעות של Fentייצור רדיקלי בתיווך. DPS מוריד את ריכוז ברזל קטליטי באמצעות מינרליזציה, צורך את חמצן זמין בתהליך. בנוסף, ל-DNA מחייב DPS פוטנציאלי עלול להגן עליו מפני נזק פיזי קיצוני ומתעבה אותו לתוך נפח קטן יותר עם שטח פנים פחות תגובתי. שילוב של שני מאפיינים אלה הופך את הגנת ה-DNA assay גם מתאים לצורך מדידת פעילות DPS מגן.
Assay הגנת ה-DNA הוא צדדי למדי ויכול לשמש למגוון רחב של יישומים מעבר לאפיון DPS. ניזק של רדיקלים הוא צורה נפוצה של מתח בתאים, וחלבונים רבים ושונים וכימיקלים המשמשים כדי לנטרל אותו. העיקרון הכללי של assay, תוך שימוש בשלמות הדנ"א כסמן לנזק של רדיקלים, ניתן להשתמש בו בשילוב עם כמעט כל תגובה קיצונית לייצור או סוכן מנטרל. בין יתר, assay כבר השתמש בהצלחה כדי לקבוע תכונות אנטי חמצונישל ק תמצית paniculata לשימוש בתעשיית מזון 15, כדי לאפיין את ההשפעות של חומצת שתן בגישור נזק הידרוקסיל 16, ולהשיג תובנות חדשות על תפקודם של חלבוני רגולטור 17 תעתיק פרווה.
למרות שימושים רבים של assay במסמכים שפורסמו, מצאנו כי אופטימיזציה רבות וצעדים לפתרון בעיות נדרשו, מה שהופך את הקמת assay בפעם הראשונה תהליך מייגע שלא לצורך לחוקרים רבים. הפרוטוקול אנו מציגים במאמר זה מטרתו להסיר את המכשול הזה לכניסה.
תהליך הטיהור של העקורים כפי שתואר במאמר זה הוא מאוד חזק. טוהר היה גבוה באופן עקבי (> 99%); אין חלבונים אחרים מופיעים בג'לי-SDS כמו להקות נראות לעין. למרות זאת, נראות כמה קבוצות של DPS המטוהר יש פעילות nuclease, כפי שמעידים השפלה DNA חלקית כאשר טופחו עם ריכוזים גבוהים מאוד של DPS. ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה למיקלה דה מרטינו, וילפרד ר 'הייגן, וKourosh Honarmand אברהימי לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק מימון מאוניברסיטת דלפט לטכנולוגיה.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
HEPES | BDH | 441476L |
Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
Sodium chloride | VWR | 443824T |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
MOPS | Calbiochem | 475898 |
SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
Equipment | Company | Model |
Static incubator | Hettich | INE500 |
Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
Syringe needles | BD | 305128 |
Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |