5/6th Nephrectomy i kombinasjon med høy Salt Kosthold og nitrogenoksidsyntase Hemming å indusere kronisk nyresykdom i Lewis Rat

Summary

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

Abstract

Kronisk nyresykdom (CKD) er et globalt problem. Bremse CKD progresjon er en stor helse prioritet. Siden CKD er karakterisert ved komplekse derangements av homeostase, integrerende dyremodeller er nødvendig å studere utvikling og progresjon av CKD. Å studere utviklingen av CKD og romanen terapeutiske intervensjoner i CKD, bruker vi 5/6th nephrectomy ablasjon modell, en velkjent eksperimentell modell av progressiv nyresykdom, likner flere aspekter av menneskelig CKD. Brutto reduksjon i renal mass forårsaker progressive glomerulær og tubulointerstitiell skade, tap av rest nefroner og utvikling av systemisk og glomerulær hypertensjon. Det er også forbundet med progressiv intrarenal kapillær tap, betennelse og glomerulosclerosis. Risikofaktorer for CKD alltid innvirkning på endotelfunksjon. Å etterligne dette, kombinerer vi fjerning av 5/6th av renal mass med nitrogenoksid (NO) reduksjon og en høy salt diett. Etter ankomst og akklimatisering, dyr reetterlønn en NO syntase inhibitor (NG-nitro-L-arginin) (L-NNA) supplementert med drikkevann (20 mg / l) i en periode på 4 uker, etterfulgt av høyresidig uninephrectomy. En uke senere, er en delsum nephrectomy (snx) utføres på venstre side. Etter snx, er dyr tillatt å komme seg i to dager, deretter LNNA i drikkevann (20 mg / l) for en ytterligere periode på 4 uker. En høy salt diett (6%), supplert i bakken Chow (se tidslinje figur 1), blir fortsatt gjennom hele forsøket. Progresjon av nyresvikt er fulgt over tid ved å måle plasma urea, systolisk blodtrykk og proteinuri. Av seks uker etter snx, har nyresvikt utvikles. Nyrefunksjonen er målt ved hjelp av "gullstandard" inulin og para-amino hippursyre (PAH) clearance teknologi. Denne modellen av CKD er preget av en reduksjon i glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) og effektiv renal plasma flow (ERPF), hypertensjon (systolisk blodtrykk> 150 mmHg), proteinuri (> 50 mg/24 timer) Og mild uremi (> 10 mM). Histologiske funksjoner inkluderer tubulointerstitiell skade reflekteres av betennelse, tubulær atrofi og fibrose og focal glomerulosclerosis fører til massiv reduksjon av sunne glomeruli innenfor rest befolkningen (<10%). Oppfølging inntil 12 uker etter snx viser videre progresjon av CKD.

Introduction

På grunn av sin progressive natur, påfølgende sluttstadiet nyresykdom, og tilhørende kardiovaskulær sykelighet og dødelighet, er CKD et økende folkehelseproblem ^en. Bremse CKD progresjon er derfor en stor helse prioritet. Siden CKD er karakterisert ved komplekse derangements av homeostase, integrerende dyremodeller er nødvendig å studere utvikling og progresjon av CKD. Den nyre består av en lang rekke ulike celletyper som samvirker med hverandre. Denne kompleksiteten kan ikke etterlignet in vitro.

Å studere nye terapeutiske intervensjoner i CKD, bruker vi 5/6th nephrectomy ablasjon modell, en velkjent eksperimentell modell av progressiv nyresykdom, likner flere aspekter av menneskelig CKD ^2,3. Brutto reduksjon i renal mass forårsaker progressive glomerulær og tubulointerstitiell skade, tap av rest nefroner og utvikling av systemisk og glomerulær hypertensjon. Det er forbundet med progressiv intrarenal kapillær tap ^4, betennelse og glomerulosclerosis. Risikofaktorer for CKD alltid innvirkning på endotelfunksjon ^fem. Vi brukte en rotte stamme (Lewis) som er relativt motstandsdyktig mot utvikling av CKD og derfor vi kombinerte fjerning av 5/6th av renal mass med nitrogenoksid (NO) uttømming ^{6, 7, 8} og en høy salt diett ^9.. Etter ankomst og akklimatisering, dyrene får en NO syntase inhibitor (L-NNA) supplementert med drikkevann (20 mg / l) i en periode på 4 uker, etterfulgt av høyresidig uninephrectomy (unx) med fortsettelse av L-NNA etter to dager . En uke senere, er delsum nephrectomy (snx) dvs. fjerning av 2/3-deler av renal mass utført på venstre side. Etter snx, er dyr tillatt å komme seg i 2 dager, deretter igjen med 20 mg / L LNNA i drikkevann i en periode på 4 uker. En høy salt diett (6%), supplert i bakken Chow (se tidslinje figur 1), blir fortsatt gjennom hele forsøket. Than grunn til å utføre UNX på høyre side og snx på venstre side er at nyrearterier er lengre på venstre side som gjør det enklere å få tilgang til nyrene uten å strekke skipene for mye når nyrene er eksponert utenfor kroppen . I litteratur, er modeller beskrevet der polene på den venstre nyre blir fjernet først, etterfulgt av unx av høyre nyre en uke senere ^10,11,12. I våre hender denne modellen viste en mye raskere utvikling av nyresvikt, men også en mye større variasjon i tap av nyrefunksjonen. Progresjon av nyresvikt er fulgt over tid ved å måle plasma urea, systolisk blodtrykk og proteinuri. Av seks uker etter snx, har nyresvikt utviklet, preget av markant reduksjon i glomerulær filtrasjonshastighet (69%) og effektiv renal plasma flow (62%) ¹³ hypertensjon (systolisk blodtrykk> 150 mmHg), proteinuri (> 50 mg/24 hr) og mild uremi (> 10 mM). Histologiske funksjoner inkluderer tubulo-interstitielle skader reflekteres av inflammasjon, rørformet atrofi og fibrose og fokal glomerulosklerose fører til massiv reduksjon av sunne glomeruli innenfor den rest populasjonen (<10%). Oppfølging inntil 12 uker etter snx viser videre progresjon av CKD, og ​​gir en mulighet for evaluering av terapeutiske intervensjoner.

Protocol

All experiments are executed in accordance to the animal experimental ethical guide lines of the Utrecht experimental animal committee. The protocol is performed under the guidance and approval of the author’s institution’s animal care and use committee. CKD is induced in male inbred Lewis rats (Charles River, Sulzfeld, Germany) at the age of 8 weeks. Rats are housed under standard conditions in a light-, temperature- and humidity-controlled environment. 1. Surgery Pr…

Representative Results

After subtotal nephrectomy, approximately 1/6th of total renal mass is left. Figure 4 shows the weight of the removed part of the right kidney with mean and standard deviation in two previous experiments. One should keep in mind that in the week after UNX, hypertrophy of the left kidney occurs; indicating that the weight that needs to be removed calculated based on the weight of the right kidney always results in less than 5/6th removal. However, since it is not possible to determine the weight of the le…

Discussion

Surgical removal of 5/6th of renal mass in the Lewis rat, combined with a high-salt diet and temporary NOS inhibition leads to a model of CKD that resembles human CKD and allows study of causal mechanisms and efficacy of therapeutic interventions in CKD.

The 5/6th nephrectomy model is a well-known and extensively described model for CKD. However, simply removing 5/6th of renal mass does not lead to immediate renal failure in all rat strains. We use Lewis rats to study the effects of cell-based…

Materials

			Reagent
L-NNA	Sigma-aldrich	N5501
Spongostan dental: gel foam pads 1x1x1 cm	Johnson&Johnson	Ms0005
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36	Ethicon	V303H
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36	Ethicon	V392H
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Via local pharmacist ordered by Reckitt Benckiser pharmaceuticals	unknown
			Equipment
Student Tissue Forceps – 1×2 Teeth 12 cm	Fine Science Tools (FST)	91121-12
Student Standard Pattern Forceps	FST	91100-12
Mayo Scissors	FST	14010-15
2X Semken Forceps	FST	11008-13
Student Iris Scissors	FST	91460-11
Olsen-Hegar Needle Holder	FST	12002-14