Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em> Ex vivo</em> Menschliche Plazentaperfusion Modell
Summary
Die<em> Ex vivo</em> Dual rezirkulierenden menschlichen Plazentaperfusion Modell kann verwendet werden, um die Übertragung von Xenobiotika und Nanopartikel in der menschlichen Plazenta zu untersuchen. In diesem Video-Protokoll beschreiben wir die Ausrüstung und Techniken für eine erfolgreiche Durchführung einer Plazenta Perfusion erforderlich.
Abstract
Vor Jahrzehnten der menschlichen Plazenta wurde gedacht, um eine undurchdringliche Barriere zwischen Mutter und das ungeborene Kind. Allerdings ist die Entdeckung von Thalidomid-induzierten Missbildungen und viele spätere Studien danach bewies das Gegenteil. Heute mehreren schädlichen Fremdstoffen wie Nikotin, wurden Heroin, Methadon oder Drogen sowie Umweltschadstoffe beschrieben, diese Barriere zu überwinden. Mit dem zunehmenden Einsatz von Nanotechnologie ist die Plazenta wahrscheinlich in Kontakt mit neuartigen Nanopartikel kommen entweder versehentlich oder absichtlich durch ein Engagement im Falle von potentiellen Nanomedizin. Daten aus Tierversuchen nicht auf den Menschen übertragen werden, da die Plazenta ist die Spezies-spezifische Säugetierorgans 1. Daher ist die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion durch Panigel et al. 2 und 1967 kontinuierlich von Schneider et al modifiziert. 3 im Jahr 1972, als ein hervorragendes Modell t dienenO Studie die Übertragung von Fremdstoffen oder Partikel.
Hier konzentrieren wir uns auf die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Protokoll und seine Weiterentwicklung, um reproduzierbare Ergebnisse zu erwerben konzentrieren.
Die Plazenten wurden nach Einwilligung der Mütter von einer unkomplizierten Schwangerschaften Kaiserschnitt unterzogen Lieferung erhalten. Die fetalen und mütterlichen Gefäße eines intakten cotyledon wurden durchbohrt und mindestens fünf Stunden perfundiert. Als Modell Partikel fluoreszenzmarkierten Polystyrol-Partikel mit Größen von 80 und 500 nm Durchmesser wurden in den mütterlichen Kreislauf aufgenommen. Die 80 nm-Partikel konnten die Plazentaschranke und bieten ein perfektes Beispiel für eine Substanz, die über die Plazenta auf den Fötus übertragen werden, während die 500 nm Partikel in der Plazentagewebe oder mütterlichen Kreislauf gehalten wurden. Die ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell ist eines der wenigen Modelle, die zuverlässige Informationen überdas Verkehrsverhalten von Fremdstoffen an einem wichtigen Gewebe Barriere, die vorausschauende und klinisch relevante Daten liefert.
Introduction
Die Plazenta ist ein komplexes Organ, das für den Austausch von Sauerstoff, Kohlendioxid, Nährstoffen und Abfallprodukten und gleichzeitig in der Lage, die beiden Schaltungen Blut der Mutter und den wachsenden Fötus voneinander getrennt zu halten. Außerdem verhindert es die Ablehnung des Kindes durch das mütterliche Immunsystem und Hormone absondert, um eine Schwangerschaft zu erhalten. Die zelluläre Barriere wird durch die Zytotrophoblastzellen die verschmelzen und bilden eine echte Synzytium ohne seitliche Zellmembranen 4,5 gebildet. Die ganze Plazenta in mehrere Keimblätter, die fetale villous Baum enthalten und stellen eine funktionelle Einheit der Plazenta organisiert.
Die Untersuchung der Plazenta-Funktion wurde mit der Entdeckung der Thalidomid Fehlbildungen induziert in den 1960er Jahren intensiviert. Aus offensichtlichen Gründen Translokation Studien mit schwangeren Frauen können nicht durchgeführt werden. Folglich wurden verschiedene alternative Modelle entwickelt 6,7 </sup>. Die vielversprechendste und wahrscheinlich klinisch relevanten Modell ist die ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell Panigel und Mitarbeiter 2,3 entwickelt.
Viele Frauen sind auf verschiedene Xenobiotika wie Drogen oder Umweltgiften während ihrer Schwangerschaft 8 ausgesetzt. Bei einigen Arzneimitteln, die bereits verabreicht wurden regelmäßig während der Schwangerschaft, kann in vivo Studien durch Vergleich der mütterlichen Blutkonzentration mit der in Nabelschnurblut durchgeführt werden. Allerdings, in der Regel gibt es nur begrenzte Informationen über die Pharmakokinetik und-dynamik in den Fötus und das Teratogenität dieser Stoffe.
Zum Beispiel Opiate wie Heroin leicht die Plazentaschranke und kann auf intrauterine Wachstumsretardierung, Frühgeburt oder Fehlgeburt 9,10 führen. Also, bei fehlender Abstinenz während der Schwangerschaft eine Substitutionstherapie mit Methadon wird empfohlen. Der Exvivo menschlichen Plazentaperfusion Modell zeigte, dass die Übertragung von Methadon in den fetalen Kreislauf vernachlässigbar 11, die korreliert gut mit dem berechneten Nabelschnurblut-to-mütterlichen Blut Konzentrationsverhältnis nach der Lieferung der 12.
Nanotechnologie ist ein wachsendes Feld vor allem in der Medizin. Also, unter dem natürlich vorkommenden feinen (<2,5 &mgr; m im Durchmesser) und ultrafeine Partikel (<0,1 &mgr; m im Durchmesser) in Rauch der Waldbrände, Vulkanausbrüche und in der Wüste Staub, die Exposition gegenüber Nanomaterialien (mindestens einer Dimension <0,1 um 13 ) steigt. Dies warf Fragen über die toxikologischen Potential Nanomaterialien. Obwohl kein Mensch Gefahr noch nachgewiesen werden konnte, gibt es Haupt-experimentelle Studien darauf hinweist, dass Nanopartikel können schädliche biologische Reaktionen, die zu toxikologischen Ergebnisse 14 verursachen. Kürzlich gaben einige Studien, dass pränataleLuftverschmutzung auf einen höheren Bedarf Atemwege und Entzündung der Atemwege bei Neugeborenen und Kinder 15,16 verbunden. Darüber hinaus können kleine Nanopartikel als Drug-Carrier verwendet werden, um speziell zu behandeln entweder den Fötus oder die Mutter. Daher wird es offensichtlich, dass umfangreiche Untersuchungen verschiedener Xenobiotika oder Nanomaterialien und deren Fähigkeit, die Plazentaschranke erforderlich sind. Eine aktuelle Übersicht über die aktuellen Studien auf Plazentagängigkeit zu Nanomaterialien in Menezes et al zusammengefasst. 2011 17 und Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.
Die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Modell bietet eine kontrollierte und zuverlässiges System für die Untersuchung der Plazenta Transport verschiedener endogener und exogener Verbindungen 3,11,12,18,19 und eine breite Palette von anderen Funktionen der Plazenta wie Mechanismen, die für die Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Präeklampsie <sup> 20-22. In diesem Protokoll haben wir vor allem auf dem Aufbau, Handhabung und Verfahren, die das Studium der Akkumulation, Effekte und Translokation Preise einer breiten Palette von Fremdstoffen oder Nanopartikeln erlauben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter dem Dual Umluftbetrieb Perfusion zeigte hier, gibt es mehrere andere experimentelle Konfigurationen möglich, abhängig von der Frage, die beantwortet werden muss. Besonders offen Plazenta Infusionen werden häufig verwendet, um die Arzneimittel-Clearance im Steady-State-Konzentration 3 zu beurteilen. Die Rückführung Perfusion Set-up kann auch angewendet werden, um den aktiven Transport von endogenen oder exogenen Substanzen zu bestätigen. Für diesen Ansatz die gleiche Konzentration des xenobiotisch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird finanziell vom Schweizerischen Nationalfonds (NFP 64 Programms, gewähren keine 4064-131232) unterstützt.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
Referências
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