ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ
Summary
この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツーハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。
Abstract
多大な努力は、大規模な総合タンパク質 – タンパク質相互作用ネットワークマップを生成するために集まっていた。これは、病原体 – 宿主の関係を理解することが尽力され、本質的に、酵母ツーハイブリッドシステムを遺伝的スクリーニングにより行った。 ガウルシフェラーゼベース断片相補アッセイによるタンパク質間相互作用検出の最近の改善は今厳格細胞因子の共通のセットに対して異なる病原体の歪み変種からのタンパク質の相互作用プロファイルを比較するために必要な統合的な比較interactomicアプローチを開発する機会を提供しています。
本稿では、具体的には、タンパク質-タンパク質相互作用データセットを生成するために2つの直交方法を組み合わせるの有用性に焦点を当て酵母ツーハイブリッド（Y2H）と新しいアッセイ、哺乳動物細胞において行わハイスループットガウヨモギタンパク質相補アッセイ（HT-GPCA）。
NTが "病原体タンパク質の細胞パートナーの>大規模同定は、複数の病原体の歪みバリアントを使用してcDNAライブラリーの交配ベース酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって実行されます。高い信頼統計的スコアで選択パートナー相互作用のサブセットがさらにあるHT-GPCAを用いた病原体の変異体タンパク質のセット全体でペアワイズ相互作用のため、哺乳動物細胞で検証。二つの相補的な方法の組み合わせは、相互作用データセットの堅牢性を向上させ、厳格な比較相互作用解析のパフォーマンスが可能になります。このような比較interactomicsは解読任意の病原体 – 宿主interplaysに信頼性が高く、強力な戦略を構成する。Introduction
タンパク質 – タンパク質相互作用マップを生成するために収集されるデータ量の増加はさらに、病原体感染を理解するための視点を開く。病原体感染症の世界的な理解が出現し始めると、それは人間のプロテオーム1を接続する場合は病原タンパク質によって誘導された摂動の範囲へのアクセスを提供します。それにより病原体が宿主細胞機械を操作する方法理解する方法を提供します。特に、いくつかのウイルス宿主相互作用ネットワークのマッピングは、ウイルスタンパク質が優先的に非常に（ハブ）セルラーネットワークに接続されている、またはネットワーク（ボトルネックタンパク質）2-4の多くのパスの中心とその宿主タンパク質を標的とすることを明らかにした。これらの相互作用は、感染性の子孫を複製し、生成する楽器である、ウイルスが重要な細胞プロセスを操作することができます。比較の相互作用のマッピングは最近に関連する情報を抽出することを目標に関連したウイルスで実施されました病因4。さらに、ホスト病原体の相互作用の風景の研究は、多くの病原体5に拡張されました。標的細胞因子の同定は、細胞に感染する病原体によって使用される戦略に洞察を提供し、潜在的な病原性マーカーの検出を可能にする。
酵母ツーハイブリッドシステムは、遺伝スクリーニングがタンパク質 – タンパク質相互作用のハイスループットマッピングのための効率的かつ高感度なツールであるため、バイナリの相互作用を同定するための最も一般的な方法である。さらにここで提案手法は、このようにして、病原体宿主タンパク質 – タンパク質相互作用の比較概要へのアクセスを提供する、複数の病原菌株変異体の蛋白質を評価することによって、個々のY2Hの上映を向上させることができる。それは全体の相互作用6の約20％を回収するため、また、酵母ツーハイブリッドスクリーニングの主な制限は、高い偽陰性率にある。これは、相互作用が病態のサブセットのみで検出されたことを意味します氏族バリアントは他の人と検出を免れたかもしれない。したがって、すべてのツーハイブリッドスクリーニングから出てくる個々のパートナーは、さらに比較の相互作用データセットを提供し、研究した株の完全な範囲との相互作用のために挑戦されています。それは別の手法を組み合わせることが強くタンパク質-タンパク質相互作用データセット7のロバスト性を増加させることが実証されたので、この検証は、HT-GPCA 8と呼ばれる新しく開発されたタンパク質断片相補アッセイにより、哺乳動物細胞中で行われる。このセルベースのシステムでは、 ガウヨモギの補完によるタンパク質相互作用の検出はルシフェラーゼを分割し、ハイスループットフォーマットと互換性があるように設計されていることができます。その発光ベースの技術のおかげで、その低バックグラウンドノイズは、他の蛍光ベースのアッセイと比較して、HT-GPCAは著しく高い感度を示しています。
全体として、このアプローチは、効率的となるハイジャックされた宿主細胞の国際理解の第一歩を表しホスト病原体のinterplaysの包括的なマッピングを生成するツール。
Protocol
Representative Results
Discussion
独立して、例えば、GSTプルダウンLUMIER又はMAPPITなどの酵母ツーハイブリッドおよび哺乳類相互作用アッセイは、タンパク質 – タンパク質相互作用を検出するための効果的なツールであることが証明されているが、偽陽性および偽陰性率の高さによって制限される相互作用は、これらの技術15に関連付けられている。また、証拠は直交の方法を組み合わせると得られた相互作用データセ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、パスツール研究所からの資金によっておよびリーグのnationale結界伤害防护结界ルがん（助成R05/75-129とRS07/75-75）、協会流動ラルシェルシュシュールルがん（/助成ARC A09からの補助金によって部分的にサポートされていました5031分の1と4867）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR07 MIME 009 02とANR09 MIEN 026 01）。 MMはMENRTのフェローシップを受賞しました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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