Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии
Summary
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в крови. Нейтрофилы обладают транскрипционно регулируется функций, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Эти функции могут быть изучены с методом, представленные здесь, которые позволяют обнаружения и количественного ядерного фактора методом проточной цитометрии в изолированных ядрах
Abstract
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови. Эти клетки являются первыми появляются на участках воспаления и инфекции, став таким образом первой линией обороны против вторжения микроорганизмов. Нейтрофилы обладают важными антимикробной функции, такие как фагоцитоз, высвобождение литических ферментов, продукцию активных форм кислорода. В дополнение к этим важным функциям защиты, нейтрофилы выполнять другие задачи, в ответ на инфекцию, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Цитокины привлечь другие лейкоциты, которые помогают очистить инфекции, и ингибирование апоптоза нейтрофилов позволяет жить дольше на месте инфекции. Эти функции регулируются на уровне транскрипции. Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнено с традиционными методами генной репортер так как нет эффективностиcient методы нейтрофилов трансфекции. Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать чистую нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализа методом проточной цитометрии. Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB и Elk-1 ядерных факторов в ядрах из нейтрофилов и других типов клеток. Таким образом, этот метод представляет собой вариант для анализа активации транскрипционных факторов в изолированных ядрах из различных типов клеток.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови 1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны 2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов 3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов 4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены терминала клеток из-за их короткой жизни, а потому, что они подвергаются апоптозу, если активированы во время воспалительного процесса 6, уже сейчас ясно, что они также могут изменить свой фенотип, изменяя уровень транскрипции определенных генов. Продукции цитокинов 5 и ингибирование апоптоза 7,8 две яmportant-зависимой активации функции клеток регулируется на уровне транскрипции в нейтрофилах. Ядерный фактор кВ (NF-kB) участвует в транскрипционным контролем цитокинов 4 производственных и в регулировании выживания клеток и апоптоз 9-11 в различных типах клеток.
Сигнальных путей, которые ведут к ядерному активация фактора, как правило, изучаются анализы гена-репортера или сдвига электрофоретической подвижности анализы (EMSA). Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнена с анализа гена-репортера, поскольку нет эффективных методов для нейтрофилов трансфекции. EMSA анализы были использованы в нейтрофилах, чтобы исследовать ядерный фактор активации 12,13, однако эта методология является сложной и дорогой, потому что она включает в себя использование радиоактивных материалов. Nucleofection является еще одним методом, который был использован successfuLLY для трансфекции моноциты 14. Таким образом, по крайней мере в теории, ядерной активация фактора могут быть обнаружены в нейтрофилах путем трансфекции (несмотря на низкую эффективность). Однако, этот метод был бы более дорогим, отнимающим много времени и, вероятно, менее количественные. Микроскопический анализ иммуноокрашиванию клетки могут быть также использованы для обнаружения ядерных факторов в ядре. Действительно, мы обнаружили NF-kB транслокации в ядро таким образом 15. К сожалению, этот метод также времени, меньше количественных и с учетом смещения наблюдателя.
Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки через интегрины или Fc рецепторов с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализ с помощью проточной цитометрии (Figure 1). Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB 15 и Elk-1 16 ядерных факторов нейтрофилов ядер. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора в ядре. Этот метод также может быть использован для анализа уровня факторов транскрипции в ядрах от других типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Очистка метод, описанный здесь позволяет изоляции нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (оценка микроскопических наблюдений), в течение короткого времени. Иногда нейтрофилы могут быть загрязнены эритроцитов, если последний не лизируются полностью. Это обычно не влия?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Нэнси Мора за техническую помощь.
Эта работа финансировалась исследовательским грантам 48573-M и 168098 от Национального совета де Ciencia у Tecnologia, Мексика и грантов IN212308 и IN205311-2 от Direccion генерала де Asuntos дель Личные Academico, Национального автономного университета Мехико, Мексика.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
Referências
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
