Teknikker for å visualisere retinal cytoarchitecture direkte tilknytning til individuelle elektroder i en retinal stimulator.
Med den siste utviklingen av netthinnens proteser, er det viktig å utvikle pålitelige teknikker for å vurdere sikkerheten til disse enhetene i prekliniske studier. Men standard fiksering, forberedelse og automatiserte histologi prosedyrer er ikke ideelt. Her beskriver vi nye rutiner for å vurdere helsen til netthinnen direkte tilknytning til et implantat. Retinal proteser har elektrode arrays i kontakt med øyevevet. Tidligere metoder har ikke vært i stand til romlig lokalisere øyevevet tilknytning til enkelte elektroder i matrisen. I tillegg resulterer standard histologisk behandling ofte i brutto artifactual avløsning av netthinnens lag ved vurdering av implanterte øyne. Følgelig har det vært vanskelig å vurdere lokaliserte skader hvis dette er tilstede forårsaket av implantasjon og stimulering av en implantert elektrode matrise. Derfor er det utviklet en fremgangsmåte for å identifisere og lokalisere det okulære vev naboliggende til implantert electrodes ved hjelp av en (fargekodet) fargestoff merkeordning, og vi endret en øyefiksjon teknikk for å minimere artifactual netthinneavløsning. Denne metoden har også gjengitt sclera gjennomskinnelig, slik at lokalisering av de enkelte elektroder og bestemte deler av et implantat. Til slutt brukte vi en matchet kontrollgruppe for å øke kraften i de histopatologiske vurderinger. I sammendrag, gjør denne metoden pålitelig og effektiv diskriminering og vurdering av retinal cytoarchitecture i et implantert øye.
Retinal proteser kan fort bli nyttige kliniske intervensjoner for behandling av ulike former for alvorlig synstap. Visse forhold, slik som retinitis pigmentosa (RP), resultere i omfattende degenerasjon av fotoreseptorer i øyet, dette er de celler som er ansvarlige for transdusering av lys inn nevrale signaler. Men noen celler i andre lag av netthinnen fortsatt, og er potensielle mål for elektrisk stimulering med en retinal protese en. Tidlige resultater fra kliniske studier har vært lovende for elektrode arrays implantert i Epiretinal 2,3, 4,5 subretinal og intrascleral seks steder. Disse enhetene er laget av forskjellige materialer med forskjellige former, men bruker elektriske pulser for å aktivere de gjenværende levedyktige nerveceller i netthinnen for å skape visuelle percepts.
Vår bredere gruppe (Bionic Vision Australia) har utviklet en retinal implantat som har progressivsed til en klinisk pilotstudie med tre RP pasienter implantert med suprakoroidale elektrode arrays (Clinical Trial Antall: NCT01603576). Figur 1A viser dette suprakoroidale prototype retinal protese.
Pasientens sikkerhet er viktig i kliniske studier, og dermed før du begynner menneskelige forsøk, utførte vi omfattende akutt og kronisk testing i prekliniske modeller (figur 1B). Histopatologiske vurderinger var viktig å avgrense de kirurgiske prosedyrer, iterere gjennom elektrode design, og til slutt etablere sikkerhet av implantatet. For å opprettholde en effektiv arbeidsflyt tappet med standard kliniske patologi praksis, ble en parafin embedding teknikk ansatt. Det var også ønskelig å anvende prosedyrer flekker med sammenlignbare kliniske standarder, for eksempel hematoxylin og eosin (H & E), som er lett tolket av pathologists. Vi ønsket også en teknikk som kan tilpasses for immunhistokjemiske analyser,For å lette videre mobilnettet evaluering av vev.
Den biocompatibility av implantatet materialer, og sikkerhet for kronisk elektrisk stimulering, må vurderes nøye. Det er viktig å være i stand til å undersøke den histopatologi av okulært vev tilstøtende til de enkelte stimulerende elektroder i matrisen. Imidlertid arrays måtte fjernes før prosessering prøvene, slik at de kan bli testet, og fordi deres metallkomponenter ikke kunne være lett seksjoneres. Derfor gjorde vår etablerte vev forberedelse ikke tillate lokalisering og kartlegging av vev med hensyn til de implanterte elektroder 7. I tillegg til mangelen på en vev lokalisering metode, resulterte standard formaldehyd-baserte fiksering og behandlingsteknikker i utbredt gjenstander og avløsning av retinal på grunn av den differensielle krympning av de forskjellige lagene i øyet (figur 2). På grunn av den ikke-homogenitet av than netthinnen, var det vanskelig å fatte gyldige sammenligninger med kontroll vev, spesielt for kvantitative målinger. Disse kombinerte begrensninger komplisert nøyaktige vurderinger av potensiell skade forårsaket av våre implantert arrays.
Her presenterer vi nye teknikker for å overvinne disse begrensningene. Vi har endret spesialiserte øyefiksjon og behandling teknikker 8-10 å opprettholde kompatibiliteten med parafin-baserte histologi. Vi har endret standard histologiske og immunhistokjemiske flekker å gi sammenlignbare resultater, basert på tilbakemeldinger fra kliniske patologer. Etter å gjengi Innbukking vev gjennomskinnelig, ble en dye-basert fargekode ansatt for å markere øyevevet tilknytning til hver enkelt elektrode, før du fjerner matrisen fra suprakoroidale plass. Ved å markere elektroden array og de enkelte elektrodestedene, kan prøvene være nøyaktig samlet inn fra elektrode naboregionene. Matchet prøvene kunne bli samlet inn fra the kontroll øye for å lette parvise sammenligninger.
Bedømme sikkerheten til implantatet er et grunnleggende hensyn for prekliniske studier. Før en retinal protese kan bli implantert i mennesker er det viktig å kontrollere at det ikke vil føre til noen skade. Dette krever en vurdering av både implantatet biokompatibilitet 17-23, så vel som en hvilken som helst potensiell skade som kan være forårsaket av vedvarende elektrisk stimulering 24-26. Erfaring med lignende nevrale proteser, som cochlea-implantat, gir innsikt i det brede spekter av stimulering, og fysiske, parametere som ikke forårsake vevsskade 27. Imidlertid har netthinnen ulike egenskaper til andre implantasjoner og derfor presise sikkerhet grenser (for eksempel maksimal ladningstetthetsfordeling) ikke kan antas fra tidligere studier i andre systemer. Charge tettheter er høyest på de aktive elektrodestedene og dette samsvarer med det største potensialet for skade. Derfor er en fremgangsmåte for lokalisering av vevet direkte tilstøtendetil de enkelte aktive elektroder vil i stor grad øke nytten av disse studiene. Den vev naboliggende til spesifikke regioner av implantatet kan det også trekkes frem for nærmere undersøkelse. Dette målrettet tilnærming tillater færre deler som skal analyseres, og samtidig bevare tillit til at "worst case scenario" ble undersøkt.
Den Innbukking fargestoff lokalisering metoden beskrevet her har blitt grundig testet med hånd-formet og støpt silikon / Pt elektrode arrays 28-30. Det har vært brukt med tynn-film polyamid arrays 7,31 og også tynn-film silikon / Pt arrays 32. Noen retinal protese studier ansatt "bullet formet" elektroder med intrascleral implantasjoner 33. Den foreliggende teknikk må være effektiv for å vurdere denne type elektroder matriser. Feline øynene med tynn sclera (tykkelse på bakre pol 90-200 mikrometer) tillatt visualisering av individuelle elektroder i en matrise. Men selv om individuelle elektrodes ikke var synlige, deres posisjoner kan lett utledes ved hjelp av et silikon-mal når konturen av matrisen kan sees (lik den som er brukt i trinn 2.6).
Fargestoffet kartlegging begrenser behovet for å oppnå ikke-relevante vev seksjoner som bare seksjoner med fargestoffet tilstede blir oppnådd. Evnen til å nøyaktig antyde elektrode posisjon ikke bare tillater relevant histopatologisk analyse og større statistisk styrke, men har en stor innvirkning på tid og kostnadsstyring ved å redusere mengden av lysbilder og kniver brukt, samt prisen på arbeidskraft. Bruken av fargestoff som er vedheftende og tåler vev behandling samtidig som den også er synlig i ufargede vevssnitt er et viktig innledende betraktning. Kunnskap om plasseringen av fargestoff og orientering av vevet ved disseksjon og under innstøping bistår skjæreprosessen. Dette omfatter korrekt orientering av blokken for å oppnå en seksjon som ikke er skrått kuttet, og gir en full representation av vevet. Det er derfor viktig at den som utfører skjæring er til stede på tidspunktet for fargestoff program, disseksjon og innebygging.
Det overordnede protokollen er robust overfor mindre endring, spesielt med fiksering timings. Men øyet disseksjon og fargestoff merking trinnene er delikat prosedyrer som drar nytte av god fingerferdighet for å unngå skade på prøven. Mens Davidsons bindemiddel har vist seg effektiv for å redusere kunstig avløsning av netthinnen nær et implantat, betyr det ikke hindrer direkte mekanisk skade under disseksjon. Davidsons bindemiddel var ikke lett kompatibelt med noen spesielle histologiske og immunhistokjemiske prosedyrer. Derfor var det behov for å endre / optimalisere disse trinnene som beskrevet ovenfor. Inkrementelle endringer i farging ganger og konsentrasjoner ble gjort før den optimale resultat ble oppnådd – for mer informasjon, se supplerende materiale.
Kvantifisering av retinalhistologi er fortsatt problematisk. Retina er ikke-homogene, og både tykkelse og celletettheten forandring med økende avstand fra området centralis 34,35. Derfor kan tilgrensende vev innenfor det implanterte øyet ikke benyttes til sammenligninger og en kontroll øye anvendes i stedet. Parvis matching av hver seksjon med kontroll øye gir oss en mer kraftig statistisk sammenligning av patologiske endringer, effekt og sikkerhet resultater med netthinnens protetikk er bedre vurderes når man sammenligner de andre øyne i et emne 36. Spesielle hensyn må tas for å minimere skrå skjæring da dette vil påvirke kvantifisering.
I sammendraget, beskrev metodene ovenfor har betydelig forbedret vår histopatologisk analyse, som igjen har ført til en mer effektiv preklinisk arbeidsflyt. Resultatene fra prekliniske studier med disse metodene direkte førte til en klinisk studie hvor 3 RP pasienter har blitt trygt implantert med suprachoroidal netthinnens proteser. Disse metodene er relevante både netthinnens stimulatorer og andre okulære implantater der patologisk respons på lang sikt implantasjon må evalueres. Denne metoden forutsatt verdt fordeler for å opprettholde cytoarchitecture og registrering av patologi til regioner av interesse på implantatet. Selv om det ikke spesifikt er testet, kan en modifikasjon av disse fremgangsmåtene kan benyttes på andre arter og andre anatomiske områder, særlig hvor en matrise er implantert overfladisk.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke: Ms Alexia Saunders og Ms Michelle McPhedran for eksperimentell assistanse, Ms Helen Feng for elektrode fabrikasjon, Dr. Penny Allen og Dr. Jonathan Yeoh for kirurgisk hjelp, Staff of the Royal Victorian øye og øre Hospital Biological Research Centre for dyr omsorg, professor Rob Shepherd for generell veiledning gjennom, og Dr. Bryony Nayagam og Mr. Ronald Leung for kritiske kommentarer til et utkast av manuskriptet.
Dette arbeidet ble utført ved Bionics institutt og St Vincent Hospital, Melbourne. Finansieringen ble gitt av Ian Potter Foundation, de John T Reid veldedige stiftelser, og den australske Forskningsrådet gjennom sin Special Research Initiative i Bionic Vision Science and Technology stipend til Bionic Vision Australia (BVA). Den Bionics Institutt erkjenner den støtten de får fra den viktorianske regjeringen gjennom sin Operasjonell Infrastruktur Support Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
The Davidson marking system | Bradley Products | 1163-4 – red 1163-5 – blue 1163-2 – yellow 1163-1- green | |
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Millipore | AB5804 | 1:1500, overnight incubation |
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody | Millipore | MAB302 | 1:100 overnight incubation |
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody | Sigma-Aldrich | N0142 | 1:100 overnight incubation |
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate) | Life Technologies | D3571 | 1:25,000 30 min incubation |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | 1:500 |
Superfrost 90° yellow | Grale Scientific | SF41299 | |
FLEX IHC Microscope Slides | DAKO | K802021-2 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | 1:500 |
Normal goat serum | Life Technologies | PCN5000 | 10% serum/0.1% Triton X-100/PBS |
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
Cresyl Violet Acetate Working Solution
Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
Aniline Blue Solution
Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution
Serum Block Solution
SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da. |