इस अनुच्छेद में, हम antisense morpholino oligonucleotides उपयोग कर वयस्क zebrafish telencephalon की निलय कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम वयस्क हड्डीवाला मस्तिष्क में कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल और त्वरित प्रोटोकॉल के रूप में इस विधि प्रस्तुत करते हैं.
ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति का हेरफेर कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. इस पत्र में, हम वयस्क zebrafish मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति मिलाना करने के लिए एक साधन के रूप में cerebroventricular microinjection (CVMI) तकनीक का प्रदर्शन. CVMI का उपयोग करके, पदार्थ cerebroventricular द्रव में प्रशासित किया जा सकता है और अच्छी तरह से मस्तिष्क की rostrocaudal अक्ष के साथ वितरित किया. हम विशेष रूप से vivo में जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं जो antisense morpholino oligonucleotides है, के उपयोग पर ध्यान केंद्रित. हमारे विधि में, जब लागू, morpholino अणुओं निलय सतह अस्तर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है. इन कोशिकाओं को तंत्रिकाजन्य पूर्वज के रूप में कार्य जो रेडियल glial कोशिकाओं, शामिल हैं. इसलिए, रेडियल glial कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक zebrafish में व्यापक न्यूरोजेनेसिस प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है, और भी रीढ़ वयस्क Neurogen उठाना पड़ सकता कैसे में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगाesis प्रतिक्रिया. इस तरह के एक समझ भी मानव neurodegenerative विकारों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रयासों में मदद मिलेगी. इस प्रकार, हम जीन अभिव्यक्ति और वयस्क zebrafish अग्रमस्तिष्क में neurogenesis प्रतिक्रिया को बदलने के लिए एक त्वरित और कारगर तरीके के रूप में cerebroventricular microinjection तरीका मौजूद है. हम भी CVMI प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए पर समस्या निवारण युक्तियों और अन्य उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं.
वयस्क neurogenesis रीढ़ को एक आम लक्षण है, लेकिन प्रसार और दक्षता की अपनी डिग्री फाइलोजेनी 1,2,3,4,5,6 साथ बदलता रहता है. Teleost zebrafish अपने पूरे मस्तिष्क 4,5,9,10 में सोलह अलग स्टेम सेल डोमेन और संबद्ध तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों में शामिल है, जबकि उदाहरण के लिए, वयस्क स्तनधारी दिमाग काफी हद तक अग्रमस्तिष्क 7,8, के लिए प्रतिबंधित स्टेम सेल क्षेत्रों के होते हैं. स्तनपायी और zebrafish के बीच यह बदलाव स्टेम सेल रखरखाव और पूर्वज कोशिकाओं की तंत्रिकाजन्य क्षमता के तंत्र में एक असमानता प्रतिबिंबित हो सकता है. zebrafish मस्तिष्क द्वारा नियोजित आणविक तंत्र मानव में neurodegenerative विकारों से निपटने के लिए चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में दिमाग में न्यूरॉन्स के उत्पादन के लिए zebrafish के आजीवन क्षमता भी नैदानिक प्रभाव पैदा कर सकता है.
वयस्क zebrafish मस्तिष्क के कई स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया है और यह दिखाया गया है किउन क्षेत्रों का निलय सतह परत कोशिकाओं पूर्वज कोशिकाओं 9,11-20 के रूप में सेवा करते हैं. Zebrafish telencephalon में विस्तृत विश्लेषण करती है, उदाहरण के लिए, तंत्रिकाजन्य पूर्वज 19, 20 होने के लिए यह मस्तिष्क क्षेत्र के निलय सतह चित्रित जो रेडियल glial कोशिकाओं की पहचान की. इस तरह के सेरिबैलम और neuroepithelial कोशिकाओं तंत्रिकाजन्य इनपुट 16,21 प्रदान ventricularly स्थित जहां ऑप्टिक tectum, के रूप में अन्य क्षेत्रों के लिए सच है. यह अंत करने, वयस्क zebrafish मस्तिष्क में व्यापक तंत्रिकाजन्य योग्यता शासी आणविक तंत्र को समझने पूर्वज कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर की आवश्यकता है.
विभिन्न तरीकों पहले से zebrafish में नियमन जीन समारोह के लिए बताया गया. ये electroporation या रासायनिक उपचार करने के लिए मिलकर एक प्रोटीन, प्लाज्मिड आधारित फोकल इंजेक्शन के वांछित वेरिएंट व्यक्त सशर्त ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी में शामिल हैं. हम पहले से एक बनाया गयावयस्क zebrafish अग्रमस्तिष्क 22 की निलय कोशिकाओं में नियमन जीन समारोह का एक त्वरित और कारगर तरीके के रूप में cerebroventricular microinjection का उपयोग कर वयस्क zebrafish मस्तिष्क में morpholino oligonucleotides या प्रोटीन सहित विभिन्न पदार्थों के प्रशासन के लिए विधि. हमारे अध्ययन में, विवो morpholinos क्योंकि covalently ऐसे electroporation के रूप में 23 अतिरिक्त permeabilization के लिए आवश्यकता के बिना ब्याज की कोशिकाओं को कुशल प्रसव जो सक्षम अमीर वितरण पेप्टाइड्स, arginine से जुड़ा हुआ morpholino अणु को शामिल उनके रसायन शास्त्र का इस्तेमाल किया गया. इस इंजेक्शन के बाद वांछित ऊतक के एक संपूर्ण लक्ष्यीकरण, बस हम वयस्क zebrafish telencephalon 22 में मनाया क्या तरह की अनुमति होगी. विवो morpholinos के प्रयोग इसलिए ऐसे इलेक्ट्रोपोरेशन या डीएनए अणु का केन्द्र इंजेक्शन के रूप में लक्षित कर ऊतक की पहले से ही मौजूदा तरीकों से बेहतर कर रहे हैं.
यहाँ, हम यह कार्रवाई करने और एक प्रदान कैसे नेत्रहीन प्रदर्शितकदम दर कदम प्रोटोकॉल. हम इंजेक्शन मिश्रण और इंजेक्शन, और इंजेक्शन तंत्र की स्थापना की है कि कैसे प्रदर्शन करके आगे बढ़ना होने की मछली की तैयारी समझाने के साथ शुरू करते हैं. हम microinjector का उपयोग कर morpholinos की खोपड़ी और इंजेक्शन में एक चीरा सृजन शामिल है जो cerebroventricular इंजेक्शन विधि, की एक विवरण प्रदान करते हैं. हम यह भी महत्वपूर्ण बिंदुओं अनुकूलन या समस्या निवारण गाइड के रूप में उन्हें बताते हुए पूरी प्रक्रिया के दौरान सतर्क रहने की एक की जरूरत पर प्रकाश डालेंगे.
हम यहाँ वर्णन विधि वयस्क zebrafish मस्तिष्क में morpholinos के लिए आसान और तेजी से प्रशासन की अनुमति देता है. हम अपनी इंजेक्शन विधि कुशलतापूर्वक निलय कोशिकाओं और neurogenesis के जवाब में कार्यात्मक परिणाम में परिणाम में जीन की अभिव्यक्ति को रोकता है कि प्रदर्शन किया है.
Cerebroventricular microinjection निष्पादित करते समय के बारे में सतर्क रहने की महत्वपूर्ण बातें हैं. उदाहरण के लिए, morpholino अणुओं के प्रभाव का इस्तेमाल किया एकाग्रता पर निर्भर करता है. यह एकाग्रता अंत उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया गया है. हम मानक भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल 28-30 उपयोग कर भ्रूण में इंजेक्शन से पूर्व परीक्षण के लिए आदर्श शेयर समाधान के साथ शुरू (500 माइक्रोन) और धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, और. इससे पहले, हम 50 माइक्रोन से 500 माइक्रोन 22 से लेकर morpholinos की सांद्रता के साथ पछाड़ना दक्षता के विभिन्न स्तरों से प्राप्त की. दूसरा, केशिका गिलास के छिद्र larg नहीं किया जाना चाहिएइस रूप में ई इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क में व्यापक तरल बाढ़ को बढ़ावा मिलेगा. यह पर्याप्त इंजेक्शन को रोकने जाएगा के रूप में इसी तरह, उद्घाटन भी संकीर्ण नहीं होना चाहिए. एक पानी के साथ एक पेट्री डिश में हवा पंप से इष्टतम छिद्र दबाव संयोजन निर्धारित कर सकते हैं. उत्पन्न होने वाली बुलबुले नहीं बल्कि कई पंक्तियों में एक ही पंक्ति में होना चाहिए. हम वीडियो में यह प्रदर्शित करता है. तीसरा, निश्चेतक में मछली incubating महत्वपूर्ण है. मछली एनेस्थेटिक्स में 2 मिनट से अधिक समय तक नहीं रखा जाना चाहिए. इस इंजेक्शन के बाद वसूली दर प्रभावित होगी. चौथा, चीरा के स्थान पर अच्छी तरह से इंजेक्शन तरल dispersing के लिए महत्वपूर्ण है. ऑप्टिक tectum अधिक निलय क्षेत्र midline के ऊपर बड़ा है और laterally संकरा हो जाता है. इसलिए, प्रयोगकर्ता midline के लिए खोपड़ी में बंद भट्ठा उत्पन्न करनी चाहिए और telencephalic क्षेत्र को कवर खोपड़ी प्लेट को सिर्फ दुम.
Cerebroventricular injectio के लाभ में से एकएन (CVMI) विधि इसके द्रुतगति है. CVMI जीन समारोह परख करने की क्रिया के लिए एक त्वरित तरीका है. आम तौर पर कई महीने लगेंगे जो कार्यात्मक अध्ययन के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी की तुलना में जब यह सुविधा महत्वपूर्ण और उपयोगी है. इसके अतिरिक्त, CVMI इंजेक्शन तरल के समान वितरण की ओर जाता है और इसलिए फोकल इंजेक्शन या electroporation की तुलना में जब जीन गतिविधि का एक अपेक्षाकृत पूरी तरह जोड़ – तोड़, प्रदान करता है. CVMI के साथ, कई जीनों इंजेक्शन की तैयारी कई morpholinos oligonucleotide युक्त घोला जा सकता से एक साथ नीचे गिरा दिया जा सकता है. CVMI एक दिया morpholino oligonucleotides के विभिन्न सांद्रता इंजेक्षन करने के लिए, और इसलिए hypomorphic phenotypes के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, इस इंजेक्शन प्रतिमान विषाक्तता का कारण या जानवरों के अस्तित्व समझौता नहीं करता.
CVMI तकनीक ऐसी modulatory पेप्टाइड्स, दवाओं, प्लास्मिड डीएनए या modulatory आरएनए मो के इंजेक्शन के रूप में अध्ययन के अन्य प्रकार के लिए विस्तारित किया जा सकता हैकोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकता है कि lecules या अन्य पदार्थ. अणुओं के संयोजन परख और खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण प्रदर्शन संभव hypomorphic phenotypes का अध्ययन करने की अनुमति, हमारे विधि का उपयोग कर रहे हैं. इन गुणों के साथ, CVMI वयस्क zebrafish मस्तिष्क में अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक त्वरित और आसान परख होना साबित करता है, और तेजी से जांच और कार्यात्मक विश्लेषण को खोलता है.
वयस्क zebrafish मस्तिष्क अनिवार्यता पूरी rostrocaudal अक्ष के साथ नए न्यूरॉन्स का उत्पादन कर सकते हैं और यह भी दर्दनाक चोटों के बाद पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस सीमित न्यूरोजेनेसिस और अगर सब पर है, बल्कि गरीब पुनर्योजी क्षमता के साथ स्तनधारी दिमाग के विपरीत में है. इस तरह बड़े पैमाने पर स्टेम सेल गतिविधि और स्वस्थ हो जाना क्षमता वर्तमान में काफी हद तक अनजान हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान के लिए आवश्यक आणविक कार्यक्रम, समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव zebrafish बनाता है. इसलिए, ज़ी की पुनर्योजी योग्यता के आणविक आधार की जांचbrafish मस्तिष्क मछली और स्तनधारी दिमाग एक चोट के बाद प्रतिक्रिया, और मनुष्यों में भी पुनर्योजी चिकित्सा उपचार के लिए अवसर प्रदान करना कैसे मौलिक अंतर की व्याख्या हो सकती है कि अनुसंधान का एक दिलचस्प क्षेत्र है. वे तंत्रिकाजन्य पूर्वज 3,8,20 के रूप में हड्डीवाला मस्तिष्क plasticity और उत्थान के आणविक बुनियादी ढांचे को समझने के क्रम में, glial कोशिकाओं एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र के रूप में सेवा करते हैं. इस प्रकार, zebrafish के मस्तिष्क के रेडियल glial कोशिकाओं में जीन समारोह में परिवर्तन करने CVMI तकनीक का उपयोग elucidating में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कैसे मछली मस्तिष्क कुशल वयस्क neurogenesis और पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जोड़े को पूर्वज गतिविधि कर सकते हैं. हमने हाल ही में वयस्क zebrafish मस्तिष्क 24,26,27 के पुनर्योजी neurogenesis के जवाब में कई कारकों और संकेत दे रास्ते की भागीदारी और आवश्यकता से पता चला है, और इन अध्ययनों CVMI विधि के प्रयोग से संभव बनाया गया. कुल मिलाकर, हम zebrafish के मस्तिष्क से हासिल ज्ञान regene लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैचोटों के लिए प्रतिक्रिया और इसलिए मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों और गंभीर चोटों के लिए नैदानिक उपचारों को डिजाइन करने में मदद मिलेगी कि स्तनधारी glial कोशिकाओं को rative क्षमता.
The authors have nothing to disclose.
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB 655) और यूरोपीय संघ (ZF-स्वास्थ्य) द्वारा समर्थित किया गया था.
Reagent/Material | |||
CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
Equipment | |||
Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |