Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
Иммуногистохимия (IHC) обеспечивает высокую точность, надежную и привлекательную визуализацию белка. Правильное исполнение и интерпретация ВВК на основе многоцветного мечения является сложной задачей, особенно когда используется для оценки взаимосвязи между целевых белков в ткани с высоким содержанием жира, например, центральной нервной системы (ЦНС).
Наш протокол представляет собой уточнение стандартной методики иммунноокрашивания особенно скорректированной для выявления структурных и растворимых белков у крыс ЦНС и периферических лимфатических узлов (LN), пострадавших от нейровоспаления. Тем не менее, с или без дополнительных модификаций, наш протокол, вероятно, может быть использован для обнаружения других связанных с ними белковых мишеней, даже в других органах и видов, чем здесь представлены.
Introduction
Несмотря на использование передовых с высокой пропускной способностью анализа, выполненного на methylome, транскриптома или даже протеома уровне, иммунное остается золотым стандартом для обнаружения белка непосредственно в образце ткани, культуры клеток или клеток мазка. Раскрывая картину локализации / распределения, иммуногистохимии (IHC) может оценить относительные соотношения и топографические взаимосвязи белков-мишеней, и даже указывают на их биологическую активность. Поэтому IHC широко используется для клинических и исследовательских целях, например, для диагностики, оценки лечения, изучение механизмов развития заболеваний, функциональных и фенотипических изменений в моделях на животных и т.д.
По существу , содержащий гистологии, патологии, биохимии и иммунологии, IHC значительно продвинулась с 1941 года, когда флуоресцентно меченые антитела были использованы впервые для определения пневмококковых антигенов в инфицированной ткани 1. Visualization клеточных продуктов и компонентов по IHC основан на связывании антител (абс) до их специфического антигена (Ag). Помимо использования флуорофора помечены антитела, иммунные реакции также могут быть визуализированы с помощью ферментов , как пероксидаза 2,3 или щелочной фосфатазы 4. Кроме того, коллоидного золота меченные антитела 5 используются для выявления специфических взаимодействия антиген-антител при помощи световой и электронной микроскопии, в то время как радиоактивные метки визуализировали с помощью авторадиографии.
Иммунореакция Ag-Ab могут быть обнаружены с помощью прямых и косвенных методов. Прямой метод, по существу , быстрее и проще, так как он использует непосредственно помечены первичной Abs 6. Тем не менее, из-за значительной потери чувствительности, косвенные методы являются предпочтительными для прямых. Двухшаговые косвенные процедуры обнаружения требуют немеченого первичного Abs, как и первый, и меченого вторичного Abs , направленные против первичного Abs, в качестве второго слоя 7.Усиление сигнала может быть достигнуто путем вовлечения в дальнейшем, с ферментом в сочетании третичный Ab (трехступенчатый косвенный метод), который связывается с вторичным Ab. Обычно используемые методы обнаружения косвенными являются авидин-биотин и пероксидазу-antiperoxidase (PAP). В качестве альтернативы, щелочной фосфатазы-antialkaline фосфатазы (APAAP) комплекс может быть использован вместо метода РАР. Следует отметить, что щелочной фосфатазы (AP) методы , как представляется, еще более чувствительны , чем методы иммунопероксидазных 4. комплексный метод авидинбиотиновом (АВС) использует биотинилированные вторичные Ab в комбинации либо с меченным авидинбиотиновом комплекса (LAB), или меченый стрептавидин-биотин комплекса (ПЛИТА). Чувствительность обнаружения может быть дополнительно увеличена за счет привлечения авидин , меченный пероксидазой или щелочной фосфатазы 8. Другие методы обнаружения в использовании полимерные маркировки, тирамин усиление и иммуно-катящегося кольца 9. Следует отметить, что различные методы обнаружения могут быть объединены для многократного обнаружения Ag в той же ткани,образец, о котором сообщалось в первый раз в 1978 году 4. Одновременный двойной иммунным окрашиванием , представленной здесь проводили в фиксированных формалином, парафин крысиных срезах тканей ЦНС и LN с использованием пероксидазы переплете и АР-конъюгированные вторичные антитела, соответственно. Сигналы визуализировали с использованием 3,3'-diaminobencidine (DAB) хромоген и быстрый синий (FB) APAAP комплекс, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стандартные процедуры IHC часто требуют определенных корректировок для получения оптимального результата, который обычно подразумевает обширный опыт, но и "проб и ошибок" подход. От подготовки ткани до целевой визуализации, почти каждый шаг в протоколе не может быть подвергнут ин?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Referências
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
