Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.
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Artigo de método
Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imuno-histoquímica (IHQ) fornece a visualização de proteínas altamente específico, confiável e atraente. execução correcta e a interpretação de um rotulagem multicolor baseado no IHC é difícil, especialmente quando utilizado para avaliar as inter-relações entre proteínas alvo no tecido com um elevado teor de gordura, tais como o sistema nervoso central (SNC).
Nosso protocolo representa um aperfeiçoamento da técnica de imunomarcação padrão particularmente adaptado para a detecção de ambas as proteínas estruturais e solúveis no rato SNC e nódulos linfáticos periféricos (LN) por neuroinflama�o afectadas. No entanto, com ou sem modificações adicionais, o nosso protocolo poderia provavelmente ser utilizados para a detecção de outros alvos de proteína relacionados, mesmo noutros órgãos e espécies que aqui apresentados.
Introdução
Apesar de a utilização de técnicas avançadas de alto rendimento análises realizadas na methylome, transcriptoma ou até mesmo nível de proteoma, imunocoloração continua sendo o padrão ouro para detecção de proteína directamente na amostra de tecido, cultura celular ou um esfregaço celular. Ao revelar o padrão de localização / distribuição, imuno-histoquímica (IHQ) pode avaliar proporções relativas e inter-relações topográficas das proteínas alvo, e até mesmo indicar as suas atividades biológicas. Portanto, IHC é amplamente utilizada para fins clínicos e de pesquisa, por exemplo, para o diagnóstico, avaliações de tratamento, estudo dos mecanismos da doença, al....
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Protocolo
Declaração de ética
O presente estudo é realizado em conformidade com as orientações do Conselho Nacional Sueco de Animais de Laboratório e a Directiva do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE), sob as licenças éticas N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, que foram aprovadas pelo Comissão de Ética do Norte Estocolmo animal.
1. Preparação do Tecido
- Perfusão e fixação
- Anestesiar os animais com isoflurano para realizar perfusão transcardial através do ventrículo esquerdo. Inicia-se a lavagem da vasculatura com salina tamponada com fosfato (PBS) para remover os componentes do sang....
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Resultados
imunomarcações duplos (co-colorações) foram realizados em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN seções. 3-5 uM fatias de tecido de espessura foram cortadas usando um micrótomo trenó, montado posteriormente em lâminas de vidro pré-revestida com adesivo e tratou-se como anteriormente descrito 10,11,12. Resumidamente, após deparaffinizing, re-hidratação do tecido e inactivação da peroxidase endógena, as secções foram submetidas ao processo de recuperação de antigénio, se.......
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Discussão
procedimentos IHC padrão muitas vezes exigem ajustes específicos para obter um ótimo resultado, que normalmente implica uma vasta experiência, mas também abordagem de "tentativa e erro". De preparação do tecido até visualização alvo, quase cada etapa do protocolo pode ser submetido a modificações concebidas individualmente, a fim de melhorar o resultado final. protocolo de coloração dupla aqui apresentado exemplifica proteínas na IHC visando particularmente ajustada para avaliar as inter-relações entre as prot.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a Hans Lassmann e Jan Bauer por sua orientação e apoio. Agradecemos também a Katalin Benedek pela excelente assistência técnica e a Caroline Westerlund pela avaliação crítica e linguística.
Este estudo foi apoiado por doações da Biogen Idec, da Fundação Wenner-Gren, do Conselho Sueco de Pesquisa, da Associação Sueca de Pessoas com Deficiências Neurológicas, da Fundação Sueca do Cérebro, do EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) e Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Isoflurano (Isoflurano): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Irradiação ocular. Provavelmente influencia a fertilidade e danifica o bebê no útero. Administrar apenas em ambiente anestesiante adequadamente equipado. |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Tampão fosfato salino (PBS), comprimido | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldeído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% em 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Perigo para a saúde. Corrosivo. Inflamável. Toxicidade aguda. |
| Etanol ≥ 99,5%, absoluto (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xileno (xilenos, grau histológico; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Toxicidade aguda. |
| Cera de Parafina Histo-Comp | Tecido-Tek | V0-5-1001 | |
| Lâminas de Microscópio Adesivas | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Substituto de xilol XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade. |
| α-CD8 (Ox-8) camundongo anti-rato, anticorpo primário | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) anti-rato, anticorpo primário | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) anti-rato, anticorpo primário | AbD Serotec | MCA341R | |
| &alfa;-eotaxina C-19 (CCL11) anti-rato de cabra, anticorpo primário | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (AP) | Dakopatts, Dinamarca | D0314 | |
| Anticorpo secundário biotinilado | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| complexo Avidin-peroxidase de rábano (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naftol fosfato AS-MX (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Toxicidade aguda. |
| Sal RR azul rápido, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Cloridrato de levamisol (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Toxicidade aguda. |
| 3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Altamente inflamável. Tóxico. |
| Sulfato de cobre (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Toxicidade aguda. Perturbação ambiental. |
| GelTol Aquoso Montagem Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Peróxido de hidrogênio, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Toxicidade aguda. |
| Metanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Toxicidade aguda. Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade. Inflamável. |
| Tris (hidroximetil) aminometano, base TRIS (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Irritação da pele e dos olhos. |
| Solução salina tamponada Tris (TBS), comprimido | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Dihidrogenofosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| Tampão de lavagem de citomação DAKO 10x | DAKO | S3006 | Deve ser armazenado a 2-8 &graus; C para inibir o crescimento bacteriano. Evite espuma. |
| N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Inflamável. Toxicidade aguda. |
| Lamínulas de vidro 24 x 36 mm | Menzel-Glä ser | BB024036A1 | |
| Ácido clorídrico, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico. |
| Solução de ácido clorídrico volumétrica, HCl 2 M (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico. |
| Nitrito de sódio, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidante. Tóxico. Perigoso para o meio ambiente. |
| Sal dissódico do ácido etilenodiaminotrilotetracético di-hidratado (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | As exposições orais podem causar efeitos reprodutivos e de desenvolvimento. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Processador de infiltração a vácuo | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Instrumentos | ||
| Vaporizador de alimentos domésticos | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Microscópio de luz | Leica Polyvar 2 |
Referências
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
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Reimpressões e permissões
