Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
Immunoistochimica (IHC) prevede la visualizzazione di proteine altamente specifiche, affidabile e attraente. corretta esecuzione e interpretazione di un etichette multicolori IHC-based è impegnativo, soprattutto se utilizzata per valutare interrelazioni tra proteine bersaglio nel tessuto con un alto contenuto di grassi come il sistema nervoso centrale (CNS).
Il nostro protocollo rappresenta un perfezionamento della tecnica immunomarcatura serie particolarmente adeguato per il rilevamento di entrambe le proteine strutturali e solubili nel ratto SNC e linfonodi periferici (LN) affetti da neuroinflammation. Tuttavia, con o senza ulteriori modifiche, il nostro protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per il rilevamento di altri bersagli proteici correlati, anche in altri organi e specie che qui presentato.
Introduction
Nonostante l'utilizzo di tecnologie avanzate high-throughput analisi effettuate sul methylome, trascrittoma o addirittura a livello del proteoma, immunostaining rimane il golden standard per la rilevazione delle proteine direttamente nel campione di tessuto, coltura cellulare o uno striscio di cellule. Rivelando il modello di localizzazione / distribuzione, immunoistochimica (IHC) può valutare i rapporti relativi e interrelazioni topografiche delle proteine bersaglio, e anche indicare le loro attività biologiche. Pertanto, IHC è ampiamente utilizzata per scopi clinici e di ricerca, per esempio, per la diagnosi, valutazioni di trattamento, lo studio dei meccanismi della malattia, alterazioni funzionali e fenotipiche in modelli animali, ecc
In sostanza comprende l'istologia, patologia, biochimica e immunologia, IHC è notevolmente avanzato dal 1941, quando gli anticorpi fluorescente sono stati utilizzati per la prima volta ad identificare gli antigeni pneumococco nel tessuto infetto 1. Visualization di prodotti cellulari e componenti per IHC si basa sul legame degli anticorpi (ABS) per la loro specifica antigene (Ag). Oltre a utilizzare fluorofori contrassegnati anticorpi, le reazioni immunitarie possono anche essere visualizzati utilizzando enzimi come la perossidasi 2,3 o fosfatasi alcalina 4. Inoltre, anticorpi oro-tag colloidali 5 sono utilizzati per rilevare specifica interazione antigene-anticorpo sia microscopia ottica ed elettronica, mentre le etichette radioattivi vengono visualizzati mediante autoradiografia.
La reazione immunologica Ag-Ab può essere rilevato tramite metodi diretti e indiretti. Il metodo diretto è sostanzialmente più veloce e più semplice, in quanto utilizza direttamente etichettato Abs primaria 6. Tuttavia, a causa della notevole mancanza di sensibilità, metodi indiretti sono preferiti a quelli diretti. Procedure di rilevamento indiretto due fasi richiedono non marcato Abs primaria, come il primo, ed etichettati Abs secondari diretti contro il Abs primario, come secondo strato 7.amplificazione del segnale può essere ottenuto coinvolgendo ulteriormente, terziaria Ab enzima accoppiato (tre fasi metodo indiretto) che si lega al Ab secondario. metodi di rilevamento indiretto comunemente usati sono avidina-biotina e perossidasi antiperossidasi (PAP). In alternativa, fosfatasi alcalina-antialcalina fosfatasi (APAAP) complesso può essere usato al posto del metodo PAP. In particolare, fosfatasi alcalina (AP) i metodi sembrano essere ancora più sensibile rispetto ai metodi di immunoperossidasi 4. metodo avidina-biotina complesso (ABC) utilizza biotinilato Ab secondario in combinazione con l'etichetta avidina-biotina complesso (LAB), o etichettato streptavidina-biotina complesso (LASTRA). Sensibilità di rilevazione può essere ulteriormente aumentata coinvolgendo avidina marcata con perossidasi o fosfatasi alcalina 8. Altri metodi di rilevamento in uso sono etichettatura polimerico, amplificazione tiramina e immuno-rolling cerchio 9. In particolare, diversi metodi di rilevamento possono essere combinati per la rilevazione multipla Ag nella stessa tessuticampione, che è stato segnalato per la prima volta nel 1978 4. simultanea doppia immunostaining qui presentata è stata eseguita in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto del sistema nervoso centrale e LN sezioni di tessuto con perossidasi-bound e AP-coniugati anticorpi secondari, rispettivamente. I segnali sono stati visualizzati con 3,3'-diaminobencidine (DAB) cromogeno e il Fast Blue (FB) APAAP complesso, rispettivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
procedure IHC standard spesso richiedono adattamenti specifici per ottenere un risultato ottimale, che implica comunemente una grande esperienza, ma anche l'approccio "trial and error". Dalla preparazione del tessuto fino visualizzazione di destinazione, quasi ogni fase del protocollo può essere soggetto a modifiche progettate in modo da migliorare il risultato finale. protocollo di doppia colorazione qui presentata esemplifica proteina IHC targeting basato particolarmente adeguato per valutare le interre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Referências
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